一粒小麥軟粒基因表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、籽粒硬度是小麥最重要的品質(zhì)性狀之一，對小麥的磨粉及加工品質(zhì)有重要的影響。籽粒硬度主要受位于5D短臂上Hardness(Ha)的兩個主效基因Puroindoline a(Pina)和Puroindoline b（Pinb）的調(diào)控及基因Grain Softness Protein-1（Gsp-1）的影響。本研究首先從一粒小麥（Triticum monococcum）DV92中克隆基因Pinam、Pinbm和Gsp-1m，然后構(gòu)建單基因過表達

2、載體3個、單基因共轉(zhuǎn)化載體3個、雙基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化載體3個、三基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化載體1個。本試驗通過基因槍介導的方式對普通小麥品種科農(nóng)199(KN199)幼胚愈傷組織進行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)化學除草劑Bialaphos篩選后獲得抗性植株;再經(jīng)PCR檢測獲得陽性植株。主要研究結(jié)果如下:
　　1.表達載體的構(gòu)建:以一粒小麥DV92的基因組DNA為模板，克隆出籽粒硬度基因Pinam、Pinbm、Gsp-1m，用PC186構(gòu)建完成了單基因過表達載體PC

3、186-Pinam、PC186-Pinbm、PC186-Gsm。用pGEM-T Easy構(gòu)建完成了單基因共轉(zhuǎn)化表達載體pGEM-Pina1m、pGEM-Pinb1m、pGEM-Gsp1m;雙基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化表達載體pGEM-Pina2m-Pinb2m、pGEMPina2m-Gsp2m、pGEM-Pinb3m-Gsp2m及三基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化表達載體pGEM-Pinb2m-Pina2m-Gsp1m。
　　2.遺傳轉(zhuǎn)化:通過組織培養(yǎng)成功誘導

4、出能用于基因槍轟擊的小麥幼胚愈傷5258個，其中用于單基因Pinam、pinbm、Gspm過表達轉(zhuǎn)化的分別有617、610、620個，用于雙基因串聯(lián)Pina2m-Pinb2m、Pina2m-Gsp2m、Pinb3m-Gsp2m共轉(zhuǎn)化的分別有718、535、937個，用于三基因串聯(lián)Pinb2m-Pina2m-Gsp1m共轉(zhuǎn)化的有1220個。
　　3.抗性植株篩選:基因槍轟擊過的愈傷經(jīng)過恢復、分化和Bialaphos篩選后，單基因Pi

5、nam、Pinbm、Gspm分別獲得抗性植株54、67、62棵，雙基因Pina2m-Pinb2m、Pina2m-Gsp2m、Pinb3m-Gsp2m分別獲得抗性植株79、43、93棵，三基因Pinb2m-Pina2m-Gsp1m獲得抗性植株114棵。
　　4.PCR檢測:單基因Pinam、Pinbm、Gspm分別獲得3、4、3棵陽性植株，雙基因Pina2m-Pinb2m、Pina2m-Gsp2m、Pinb3m-Gsp2m分別獲得1

6、、0、2棵陽性植株，三基因Pinb2m-Pina2m-Gsp1m獲得4棵陽性植株。
　　5.單基因T0代植株轉(zhuǎn)錄水平檢測:RNA反轉(zhuǎn)，通過PCR檢測，單基因Pinam、Pinbm、Gspm轉(zhuǎn)基因植株分別各有2棵能擴增出與預期片段大小一致的片段，說明這三個基因已在小麥轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄。
　　本研究對克隆出的Pinam、Pinbm、Gsp-1m基因進行組合，分別構(gòu)建了單基因、雙基因及三基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化表達載體進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)