葡萄無核育種技術(shù)研究及種質(zhì)創(chuàng)新.pdf

1、葡萄育種中,無核是其重要的選育目標之一。隨著人們生活水平的不斷提高,無核葡萄在鮮食和制干上顯示出越來越重要的作用。在國際市場中,銷售量最大、最受人們歡迎的鮮食和制干品種主要是無核品種。但目前無核葡萄品種少,現(xiàn)有的品種大多果粒小、結(jié)實率低、無香味或香味不濃,培育經(jīng)濟性狀優(yōu)良的無核品種是葡萄育種的重要方向之一。 無核葡萄育種開始于美國,主要通過傳統(tǒng)雜交育種方式。現(xiàn)育出的無核品種中絕大多數(shù)(70％多)是以有核品種為母本,無核品種作父本

2、進行人工雜交育成。毋庸置疑,雜交育種無論是過去、現(xiàn)在和將來都是無核葡萄品種育種重要的方法。近年來,隨著生物技術(shù)的發(fā)展,胚和胚珠培養(yǎng)技術(shù)、三倍體育種技術(shù)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在葡萄育種和生產(chǎn)上應(yīng)用以及基因轉(zhuǎn)導等技術(shù)為培育無核品種提供了新方法和新思路。 本研究主要根據(jù)無核葡萄形成的機理,利用生長調(diào)節(jié)劑花前處理無核葡萄品種形成種子；二倍體與四倍體雜交培育三倍體；利用四倍體自交產(chǎn)生三倍體；實生條件下二倍體雄性不育種質(zhì)獲得；以及葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系建

3、立和轉(zhuǎn)雄性不育Barnase基因種質(zhì)獲得等方面研究葡萄無核品種選育的可能途徑。取得主要研究結(jié)果如下： 1.利用植物生長調(diào)節(jié)劑促使假單性結(jié)實的無核葡萄產(chǎn)生具有生活力的種子,采用或不采用胚培養(yǎng)產(chǎn)生實生苗,為無核葡萄育種提供一條便捷途徑。采用不同生長素類和細胞分裂素類生長調(diào)節(jié)劑對‘火星無核’葡萄花前2w進行不同濃度的處理,對果實的有核率、種子形成大小、單果種子數(shù)目及種子成苗等方面進行了研究。BA、CPPU、KT、IAA、IBA、NAA

4、不同濃度的處理都能使‘火星無核’葡萄產(chǎn)生殘核。BA 5mg/L、10 mg/L,IAA 10 mg/L、20 mg/L,IBA 20 mg/L的處理有核率達100％；KT 5 mg/L處理種子大小指數(shù)96.6％,為最大,而CPPU 10 mg/L處理種子大小指數(shù)74.5％,為最??；BA 5 mg/L處理單果的平均種子數(shù)3.1粒,CPPU 10 mg/L處理單果的平均種子數(shù)0.5粒。KT 5 mg/L和10 mg/L處理誘導產(chǎn)生的種子離體

5、培養(yǎng)得到萌發(fā)苗。不同濃度KT和BA處理‘火星無核’葡萄幼果內(nèi)源IAA、iPAs及IAA/iPAs在花后1w明顯高于對照。結(jié)果表明,生長素類和細胞分裂素類生長調(diào)節(jié)劑可以促進無核葡萄形成具有生活力的種子,可為無核葡萄育種提供了一種新的簡便方法。 2.以二倍體葡萄品種和四倍體葡萄品種為親本進行正反交,采用胚珠培養(yǎng)和田間自然播種雜交種子的方法,以期獲得三倍體雜種單株。不同品種組合雜交坐果率不同,魏可(2x)×翠峰(4x)組合坐果率達41

6、.03％,紅高(2x)×巨峰(4x)的組合雜交坐果率為0％,不同組合間差異顯著；取花后70d的胚珠接種于MS基本培養(yǎng)附加不同激素的培養(yǎng)基中,亞歷山大(2x)×翠峰(4x)組合獲得5株實生苗。自然播種雜交種子215粒,其中雜交組合‘魏可’ב翠峰’、‘巨峰’ב紅高’、‘魏可’ב巨峰’的種子發(fā)芽成苗,成苗率分別為33.33％、20.00％、1.85％。 3.取四倍體品種‘翠峰’自交種子進行播種,通過流式細胞儀檢測實生后代的單株染

7、色體倍性,發(fā)現(xiàn)單株2004-5-11為三倍體植株；該單株花粉粒通過電子顯微鏡掃描顯示花粉粒大多呈三角型,與‘夏黑’(3x)花粉粒形態(tài)相近；葉片氣孔大小為0.04×0.022mm(L×B);花前套袋自交果粒為2.71g,無核,花期12.5 mg/L GA3處理一次,花后10d 25 mg/LGA3+5mg/L CPPU再處理一次,果實為15.61g,無核率100％,可溶性固型物(TSS)為16.7 Brix°,該單株為一優(yōu)異的三倍體種質(zhì)。

8、 4.從‘魏可’(Wink)葡萄自交實生群體中發(fā)現(xiàn)一株雄蕊反卷的單株(2004-6-12),經(jīng)花粉生活力測定、花粉粒電鏡掃描和電鏡透射觀察,結(jié)果表明：該單株花粉粒在人工培養(yǎng)基上發(fā)芽率為0％,電鏡掃描花粉粒為圓球形、小型、無發(fā)芽孔和發(fā)芽溝,外壁紋飾為網(wǎng)狀,花粉粒橫切面邊緣光滑,確定為雄性不育單株(雌能花);該單株經(jīng)花期GA3 25 mg/L和花后10d GA3 25 mg/L+CPPU 5 mg/L處理,單果10.2g,果實無核率

9、100％,可溶性固形物(TSS)23 Bdx°,果實紫紅色,品質(zhì)優(yōu)良。 5.以‘美人指’葡萄帶腋芽的幼嫩莖段為外植體,研究了外植體的采集時間、節(jié)位、和消毒方法因素對‘美人指’葡萄無菌苗體系建立的影響。結(jié)果表明,晴天采集2～4節(jié)位的莖段,采用70％酒精10s+0.1％升汞6min+含0.05％吐溫的2％次氯酸鈉6min方法消毒,外植體成活率達80％以上,萌芽率達90％。成功的建立‘美人指’葡萄無菌體系。 對6-BA、TDZ

10、與IBA不同濃度組合對‘美人指’葡萄葉片、葉柄和莖段不定芽離體誘導再生植株的效果進行了研究。結(jié)果表明：以莖段為外植體在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.01 mg/L培養(yǎng)基上分化效果最好,再生率75.00％：葉片、葉柄分別在MS+6-BA 3.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.05 mg/L培養(yǎng)基上分化效果較好,再生率分別為63.16％和40.00％:TDZ和IBA的幾種組合

11、都能誘導不定芽再生,但再生率不高。 6.以‘美人指’葡萄離體葉片及葉柄為農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化Barnase基因的受體,對農(nóng)桿菌侵染時間、共培養(yǎng)時間、預(yù)培養(yǎng)時間、卡那霉素選擇壓以及頭孢霉素濃度等因素進行了研究。結(jié)果表明：農(nóng)桿菌侵染4min,共培養(yǎng)3d,卡那霉素選擇壓2.5mg/L,頭孢霉素濃度250mg/L為最佳的農(nóng)桿菌介導法‘美人指’葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系。 7.采用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化體系,對‘美人指’進行轉(zhuǎn)化,共獲得了13株抗性

12、苗,農(nóng)桿菌侵染后的抗性陽性率為1.92％。利用GUS組織化學染色、PCR擴增的方法進行檢測,結(jié)果表明,其中2株抗性苗GUS染色呈陽性,且1株P(guān)CR檢測呈陽性,初步證實Barnase基因已經(jīng)整合進入‘美人指’葡萄基因組中。 8.以‘魏可’葡萄花序為農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化Barnase基因的受體,利用花粉管通道法對魏可進行轉(zhuǎn)化,共獲得了50株后代單株。利用GUS組織化學染色、PCR擴增的方法進行檢測,結(jié)果表明,13株GUS染色呈陽性,GUS陽性率為