中國野生葡萄芪合酶基因轉化無核葡萄品種的研究.pdf

1、本研究以愛莫無核葉片、葉柄和無核白花藥、子房等外植體為試材，通過器官發(fā)生途徑和胚狀體發(fā)生途徑建立了葡萄再生體系；并將攜帶有中國野生葡萄芪合酶基因的植物表達載體pWR306，通過農桿菌介導法對愛莫無核葉片葉柄、長穗無核白葉柄、無核白胚狀體及胚性愈傷進行遺傳轉化，研究了潮霉素(Hyg)篩選濃度、頭孢霉素(Cef)脫菌濃度、農桿菌侵染濃度、預培養(yǎng)時間等遺傳轉化因素；并通過Hyg篩選、PCR檢測、Southern雜交等方法對外源基因的整合進行了

2、檢測。取得的主要結果如下： 1.葡萄再生體系的建立 (1)器官發(fā)生途徑再生體系的建立 以愛莫無核葡萄的葉片、葉柄為材料，通過研究不同激素濃度組合對外植體愈傷誘導及不定芽分化的影響，建立了葡萄器官發(fā)生途徑的再生體系。葉片再生適宜培養(yǎng)基為MS+TDZ2.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，再生率為21.57％；葉柄再生適宜培養(yǎng)基為MS+TDZ1.0mg·L-1，再生率為2.08％；不定芽伸長培養(yǎng)基為MS+TDZ

3、0.25mg·L-1+NAA0.01mg·L-1；生根成苗培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.1mg·L-1。 (2)胚狀體發(fā)生途徑的建立 以無核白葡萄花藥、子房為材料，研究葡萄胚狀體發(fā)生途徑的再生。結果表明：無核白的花藥和子房胚性愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基分別為MS+BA4.0mg·L-1+2,4-D0.5mg·L-1+3％蔗糖和MS+BA4.0mg·L-1+2,4-D1.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1；胚狀體誘導培養(yǎng)基為M

4、S+BA4.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1；在無激素的MS培養(yǎng)基中胚狀體很快萌發(fā)；成苗培養(yǎng)基為WPM+蔗糖15g·L-1。 2.遺傳轉化體系的優(yōu)化 (1)Hyg選擇壓的確定 以愛莫無核葉片和擴繁單芽莖段為試材，研究Hyg對葡萄葉片不定芽再生及植株生長的影響，確定了Hyg篩選濃度和篩選方式。葡萄遺傳轉化后進行延遲篩選，并逐步增加潮霉素的濃度，起始濃度為3mg·L-1再逐步增加至12mg·L-1可減少對再生的抑制

5、。 (2)脫菌素Cef濃度的確定 以愛莫無核葉片為試材，研究Cef對不定芽再生的影響，確定了Cef的最佳脫菌濃度為400mg·L-1。 (3)農桿菌侵染濃度的確定 分別以葉片、葉柄、胚狀體和胚性愈傷為試材，研究在不同濃度農桿菌下脫菌的難易，確定了不同外植體侵染時農桿菌的最佳侵染濃度。葉片、葉柄適宜的OD600值為 0.3～0.5；胚狀體為0.3～0.4；胚性愈傷為0.3。本試驗選取OD600=0.

6、3進行遺傳轉化。 (4)預培養(yǎng)時間的確定 以愛莫無核葡萄葉片為試材，研究葉片預培養(yǎng)時間對遺傳轉化的影響，確定葉片遺傳轉化的最佳預培養(yǎng)時間為9天。 3.外源基因的檢測 (1)潮霉素篩選 農桿菌介導法轉化愛莫無核葉片、葉柄和長穗無核白葉柄，經潮霉素篩選后分別獲得17和82株抗性芽，愛莫無核抗性芽伸長緩慢，2個抗性芽成苗；長穗無核白共有38個抗性芽生根成苗，成苗率為46.34％。 轉化后的無核白

7、小植株經潮霉素篩選后，共獲得49個抗性株系。 (2)PCR檢測外源STS基因的整合 分別對20個長穗無核白的抗性株系及選取的15個無核白抗性株系進行PCR擴增。結果有11個長穗無核白和7個無核白抗性株系擴增出約1288bp的特異條帶，而非轉基因的葡萄對照無特異性條帶出現(xiàn)。初步表明外源基因已經整合進植株的基因組中。 (3)Southern雜交 分別對PCR檢測為陽性的5個長穗無核白株系進行Southern雜