柑桔無(wú)核機(jī)理及無(wú)核性狀分子標(biāo)記研究.pdf

1、無(wú)核作為一個(gè)重要的園藝性狀，在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中被選擇保留下來(lái)；無(wú)核果實(shí)以其食用方便、品質(zhì)優(yōu)良而倍受人們的青睞，其無(wú)論在鮮食和加工上都具有重要意義。上世紀(jì)60年代以來(lái)，國(guó)外已逐步將鮮食品種無(wú)核化，當(dāng)今國(guó)際柑桔市場(chǎng)上的名牌品種都是無(wú)核或少核的；我國(guó)柑桔品種資源十分豐富，地方良種很多，但栽培的品種多是有核甚至多核的，因而影響了商品價(jià)值和在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。因此，培育無(wú)核或少核品種是柑桔育種的重要目標(biāo)，研究柑桔無(wú)核的內(nèi)在成因，有著極其重要的意

2、義。目前對(duì)柑桔無(wú)核機(jī)理的研究多集中在形態(tài)學(xué)和解剖生理等方面，而利用分子生物學(xué)的手段進(jìn)行基因水平上的研究開(kāi)展的工作還較少，對(duì)柑桔無(wú)核的分子機(jī)制缺乏相應(yīng)的了解。 本研究以無(wú)核椪柑新品種‘麗椪2號(hào)’為材料，以麗水當(dāng)?shù)仄胀ㄓ泻藯崭虨閷?duì)照，從雄配子體育性、雌配子體育性和自交親和性等方面方面系統(tǒng)查明‘麗椪2號(hào)’椪柑的無(wú)核成因；為了尋找與柑桔無(wú)核基因相連鎖的分子標(biāo)記，分別以8個(gè)椪柑品種和4個(gè)本地早桔株系為材料，采用AFLP分析的方法，來(lái)分離椪

3、柑無(wú)核品種和本地早無(wú)核變異株系的特異AFLP標(biāo)記片段，并比較了這些片段序列與已知功能基因的同源性，以期對(duì)以后柑桔無(wú)核基因的精細(xì)定位和全基因克隆做一些初步的探索。本試驗(yàn)主要研究結(jié)果如下： 1.‘麗椪2號(hào)’的無(wú)核成因1.1 ‘麗椪2號(hào)’花粉低育。花藥花粉粒數(shù)量、花粉萌發(fā)能力和花粉染色活力都顯著低于有核品種?！悧?號(hào)’椪柑和有核對(duì)照每?；ㄋ幍钠骄ǚ哿?shù)量分別為25300和41500個(gè)，二者的差異達(dá)到了顯著水平；在篩選出的最佳蔗糖濃

4、度培養(yǎng)基(1％瓊脂+20％蔗糖+0.01％硼酸)上，‘麗椏2號(hào)’和有核對(duì)照花粉發(fā)芽率兩年的測(cè)定結(jié)果分別為1.18％和15.05％，0.82％和14.35％；花粉染色活力兩年的測(cè)定結(jié)果分別為9.27％和50.23％，9.18％和45.07％。 1.2 掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)兩品種花粉粒在微觀結(jié)構(gòu)方面存在很大的差異。有核花粉為長(zhǎng)球形或近長(zhǎng)球形，飽滿，外壁網(wǎng)眼大，有4～5條萌發(fā)溝明顯可見(jiàn)，萌發(fā)溝淺，溝界極區(qū)大；‘麗椪2號(hào)’花粉表現(xiàn)為畸形的凹

5、癟狀或棗核狀，多處條狀凹陷，外壁網(wǎng)眼小，呈陷點(diǎn)狀，萌發(fā)溝有4～5條，但為窄帶狀，溝腹較深，溝界極區(qū)小，萌發(fā)孔內(nèi)陷。 1.3 ‘麗椪2號(hào)’花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂存在異常。通過(guò)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期染色體行為觀察發(fā)現(xiàn)，‘麗椪2號(hào)’的花粉母細(xì)胞有分裂異常的情況出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為分裂前期Ⅰ出現(xiàn)染色體鏈和染色體環(huán)，后期Ⅰ在有些母細(xì)胞中還出現(xiàn)不均等分裂和落后染色體現(xiàn)象。其中染色體鏈比例高達(dá)37％，組成鏈的染色體個(gè)數(shù)從3～9個(gè)不等，染色體環(huán)的比例約為

6、8％，最典型的是細(xì)胞中出現(xiàn)了染色體鏈上套有染色體環(huán)。這些染色體異常都會(huì)導(dǎo)致‘麗椪2號(hào)’的花粉畸形，進(jìn)而造成花粉低育。 1.4‘麗椪2號(hào)’胚囊敗育石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，有核對(duì)照到受精后第7天可見(jiàn)胚囊內(nèi)受精卵已經(jīng)進(jìn)行有絲分裂發(fā)育成球形胚，而‘麗椪2號(hào)’在胚囊發(fā)育過(guò)程中，在花后第2天觀察到胚囊二核期，花后4～5天的胚珠中觀察到了胚囊四核期，但是在其后的連續(xù)切片中未發(fā)現(xiàn)有八核期的胚囊，‘麗椪2號(hào)’胚囊敗育的時(shí)期從四核期開(kāi)始，隨著發(fā)育進(jìn)程，‘

7、麗椪2號(hào)’胚囊中空，其形狀由長(zhǎng)形逐漸變?yōu)閳A形，圓形空腔逐漸增大，到花后第11～12天在珠心中出現(xiàn)明顯的球形空腔。 1.5雜交試驗(yàn)‘麗椪2號(hào)’無(wú)論是自花授粉還是授以高育性的雪柑花粉，在授粉后17天和96天的座果率差異都不顯著，說(shuō)明其無(wú)核性狀不是由自交不親和造成的；雜交‘麗椪2號(hào)’最終得到65個(gè)果實(shí)中只得到1粒種子，幾乎全為無(wú)核果，證明‘麗椪2號(hào)’的無(wú)核性狀是由雌性器官敗育引起的。但是通過(guò)授粉能夠促進(jìn)子房的發(fā)育，使其座果。

8、2.柑桔無(wú)核性狀的分子標(biāo)記研究2.1采用AFLP和DNA分池技術(shù)相結(jié)合的方法，分析了8個(gè)有代表性的椪柑品種，72對(duì)引物組合中有13個(gè)引物組合初步篩選到19個(gè)多態(tài)性片段，將這些差異片段進(jìn)一步在8個(gè)個(gè)體中驗(yàn)證，共得到5個(gè)無(wú)核基因連鎖標(biāo)記AFLP-1、AFLP-2、AFLP-3、AFLP-4和AFLP-5；片段大小從128bp到267bp不等，所有序列提交Genebank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，Blast結(jié)果顯示，標(biāo)記AFLP-1與擬南芥種子發(fā)育缺陷

9、突變體(titan)TTN基因家族成員ttn8基因和染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白(SMC1)編碼基因片段都有73％的一致性；AFLP-2與擬南芥一種GTP酶激活蛋白(GTPase-Activating Protein，GAP)編碼基因部分序列的一致性為80％；AFLP-3與擬南芥ATP依賴性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員PGP18編碼基因和ATP結(jié)合運(yùn)輸?shù)鞍拙幋a基因片段分別有71％和69％的一致性；AFLP-4與梨屬植物ATP合成酶基因和鐵氧還蛋白谷氨酸合成

10、酶基因比對(duì)區(qū)域的一致性同為83％；AFLP-5片段序列與擬南芥糖基水解酶家族蛋白17編碼基因和beta-1.3-葡聚糖酶相關(guān)蛋白編碼基因序列片段也都有73％的一致性。這些結(jié)果表明，分離得到的5個(gè)特異標(biāo)記片段與上述功能基因都有一定的同源性。 2.2采用相同的引物組合和方法對(duì)來(lái)自浙江黃巖的4個(gè)本地早桔株系(3個(gè)無(wú)核變異株系，1個(gè)有核株系)進(jìn)行分析，72對(duì)引物組合中篩選出12對(duì)多態(tài)性較好的引物進(jìn)行最終擴(kuò)增；得到了9條清晰穩(wěn)定的特異片斷