羅格列酮通過下調(diào)IGF-1的表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)凋亡.pdf

1、隨著對(duì)PPARs基因的深入了解，PPARγ在腫瘤中的作用日益成為學(xué)者們研究的焦點(diǎn)，有不少研究證明，其激動(dòng)劑在乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌研究中能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和死亡等預(yù)后不良的重要因素[1-3]。其中PPARγ的特異性配體能誘導(dǎo)多種腫瘤的終末分化,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在脂肪肉瘤和前列腺癌患者的臨床治療中，PPARγ配體已經(jīng)顯示了良好的抑制腫瘤效果。隨著淋巴管內(nèi)皮特異標(biāo)記物和淋巴管生長因子的發(fā)

2、現(xiàn)，NSCLC誘發(fā)淋巴管生成的分子機(jī)制和以淋巴管生成(lymphangiogenesis)作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)的研究已成為目前研究的熱點(diǎn)之一，抑制腫瘤新生淋巴管可能為控制非小細(xì)胞肺癌淋巴道轉(zhuǎn)移提供新的思路，為此，本研究選擇跟PPARγ表達(dá)有關(guān)的非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，來證實(shí)羅格列酮通過下調(diào)IGF-1的表達(dá)來抑制非小細(xì)胞肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)凋亡，意在尋找治療非小細(xì)胞肺癌的一種更好的方法和藥物。
　　 胰島素樣生長因子(I

3、nsulin-like growth factor，IGF)特別是IGF1不僅能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的無限增殖，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切，IGF-1可作為非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷指標(biāo)。羅格列酮是過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑，它能夠誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌凋亡并抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。并且，羅格列酮已被證明能夠通過PI3K/Akt途徑抑制乳腺癌細(xì)胞中IGF-I的表達(dá)。據(jù)此我們推測羅格列酮可能通過抑制I

4、GF-I的來抑制肺癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。為此，本試驗(yàn)觀察羅格列酮作用與A549細(xì)胞后IGF-1的表達(dá)，研究并探討羅格列酮抑制非小細(xì)胞肺癌增值及轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　 【研究目的】
　　 探討羅格列酮通過下調(diào)IGF-1的表達(dá)來抑制非小細(xì)胞肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)凋亡。
　　 【研究方法】
　　 1. A549細(xì)胞的培養(yǎng)及羅格列酮對(duì)A549細(xì)胞的處理；
　　 2.采用Hoechst3222染色法檢測羅格列酮對(duì)肺癌

5、A549細(xì)胞凋亡的影響：轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，Hoechst3222染色，于熒光倒置顯微鏡下觀測胞核變化。分別取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)凋亡變化的細(xì)胞個(gè)數(shù)所占比例為凋亡率，取平均值，并與空白對(duì)照組細(xì)胞做比較。重復(fù)研究3次；
　　 3.透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；
　　 4. Real time PCR檢測羅格列酮對(duì)A549細(xì)胞VEGF-C表達(dá)的影響；
　　 5.采用免疫熒光化學(xué)法觀察羅格列酮處理A549細(xì)胞后VEGF-

6、C的表達(dá)：
　　 6. Western blot對(duì)下調(diào)后的IGF-1進(jìn)行半定量分析:羅格列酮處理細(xì)胞24小時(shí)后，提取細(xì)胞的總蛋白，Bicinchoninic acid assay(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，目的條帶用AlphaEaseFC軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。PPARγ條帶與actin條帶吸光度的比值表示蛋白表達(dá)量；
　　 7.對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)

7、行描述，凋亡率采用x2分析，VEGF-C及IGF-1的表達(dá)采用方差分析。
　　 【研究結(jié)果】
　　 1.羅格列酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡呈濃度依賴性，濃度分別為0，10，20，30μM的羅格列酮，處理48小時(shí)后，凋亡率分別為0.012±0.033、0.105±0.177、0.388±0.201、0.437±0.189; A549細(xì)胞在在處理后出現(xiàn)早期核凋亡改變，核膜皺縮，成波浪狀，染色體凝集成塊狀。48小時(shí)后，凋亡細(xì)胞明顯增

8、加，染色質(zhì)致密濃染呈粗大的顆粒狀，邊集，或整個(gè)核呈輻輪狀；有些細(xì)胞已有凋亡小體突出；或整個(gè)細(xì)胞核致密濃染，或分裂成凋亡小體。并用透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變
　　 2.羅格列酮下調(diào)VEGF-C的表達(dá)，羅格列酮作用48小時(shí)后，可見處理組的熒光比空白組明顯減弱，而陰性對(duì)照組未見特異性熒光表達(dá)。
　　 3.羅格列酮下調(diào)IGF-1的表達(dá)成濃度依賴性，羅格列酮處理A549細(xì)胞24小時(shí)后， IGF-1的表達(dá)量分別為0.761±0.