古典H1N1亞型豬流感病毒PB2 K627E突變對(duì)病毒復(fù)制能力的影響.pdf

1、豬流感(Swine Influenz，SI)的病原是豬流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)，為豬的一種常患病。該病特點(diǎn)為傳播速度快、發(fā)病率高，對(duì)仔豬特別是免疫力較弱的仔豬的致死率較高。雖然SIV感染一般不會(huì)導(dǎo)致豬的死亡，但由于其具有發(fā)病率高、導(dǎo)致免疫力下降、伴隨或繼發(fā)感染其他疾病甚至可能會(huì)傳染給人類(lèi)等特點(diǎn)，因此對(duì)SIV分子致病機(jī)制的研究日趨迫切。
　　反向遺傳操作技術(shù)廣泛用于流感病毒分子致病機(jī)理的研究，本

2、研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離到的古典H1N1亞型SIV(A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1))為實(shí)驗(yàn)材料，成功拯救出病毒，血凝檢測(cè)結(jié)果表明病毒具有血凝活性。為探究古典H1N1亞型SIV拯救株與野生株的生物學(xué)特性的異同，分別在MDCK細(xì)胞上進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果表明:拯救株與野生株在同一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞病變(CPE)一致;血凝效價(jià)均為26;相同條件下在同一時(shí)間點(diǎn)空斑形態(tài)大小一致;差異顯著性分析結(jié)果表明生長(zhǎng)曲線差異不顯著;序列分析表

3、明拯救株與野生株序列一致。以上結(jié)果表明拯救株與野生株的生物學(xué)特性一致。
　　禽源H1N1亞型SIV在我國(guó)豬群中廣泛流行，造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。本研究以一株禽源H1N1亞型SIV(A/Swine/Tianjin/6/2012(H1N1))為實(shí)驗(yàn)材料，利用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出病毒八片段后，膠回收純化后連接PBD后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得流感病毒拯救株，血凝試驗(yàn)檢測(cè)病毒具有血凝活性，表明病毒拯救成功。
　　PB2627位氨基酸

4、位點(diǎn)是流感病毒重要的毒力分子標(biāo)記，能夠影響人流感病毒和禽流感病毒在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制，但其對(duì)SIV的復(fù)制有何影響還不是很清楚。本研究在成功建立的古典H1N1亞型SIV的反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上，利用點(diǎn)突變的技術(shù)將該位點(diǎn)的賴(lài)氨酸(K)突變?yōu)楣劝彼?E)，分別在細(xì)胞和小鼠上對(duì)其復(fù)制能力進(jìn)行研究。結(jié)果表明，相同情況下，突變株(627E)與拯救株(627K)相比，CPE程度較小;空斑形態(tài)明顯減小;生長(zhǎng)曲線在24h、36h、48h時(shí)差異極其顯

5、著(P＜0.001)，60h、72h時(shí)差異非常顯著(P＜0.01)。小鼠試驗(yàn)結(jié)果表明，突變株(627E)對(duì)小鼠的致病性較弱，不會(huì)導(dǎo)致小鼠體重下降，而拯救株在接種第5d時(shí)體重下降，第8d出現(xiàn)死亡，至第10d體重逐漸恢復(fù)，第13d恢復(fù)至正常增長(zhǎng)水平。取第3d、5d肺臟組織測(cè)定病毒滴度，差異性分析結(jié)果表明差異極其顯著;肺臟病理切片結(jié)果表明拯救株炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，可見(jiàn)多個(gè)浸潤(rùn)灶，部分肺泡壁增粗，而突變株僅表現(xiàn)為局部炎性細(xì)胞灶病變，表明突變株與拯