新型PA-X蛋白及PB2-627位氨基酸對豬流感病毒復制和致病能力的影響.pdf

1、PA-X是由Jagger等人在2012年發(fā)現(xiàn)的一種由于PA基因發(fā)生+1核糖體移碼產(chǎn)生的一種新型蛋白。目前關于PA-X的功能研究主要圍繞1918年西班牙H1N1人流感病毒、2009年甲型H1N1人流感病毒、高致病性H5N1及H9N2禽流感病毒進行。然而，PA-X對于豬流感病毒復制和致病能力的影響仍舊沒有得到證明。為了探究 PA-X蛋白對豬流感病毒復制和致病能力的影響，我們在古典H1N1亞型豬流感病毒的反向遺傳操作平臺基礎上，通過點突變構建

2、了PA-X缺失的重組質(zhì)粒，拯救了野生株和PA-X缺失株。通過比較野生株和PA-X缺失株在體外細胞系和小鼠體內(nèi)的復制和致病能力來解析PA-X對豬流感病毒生物學特性的影響。此外，我們還比較了野生株和PA-X缺失株聚合酶活性的差異。研究結果表明：PA-X缺失明顯增強了古典 H1N1亞型豬流感病毒在 MDCK和A549細胞上的復制水平，在PK-15細胞上兩者的復制能力雖然沒有明顯的差異，但缺失株也略高于野生株；PA-X缺失導致病毒在小鼠肺臟的復

3、制能力得到提高，肺臟的病變更加嚴重，表現(xiàn)為體重下降幅度增大，致死率提高；PA-X缺失后豬流感病毒的聚合酶活性提高。
　　大多數(shù)情況下PA-X的C末端由X-ORF編碼的61個氨基酸構成，但在某些情況下，X-ORF會由于在第42個密碼子處TGG(Trp）突變?yōu)門AG（終止密碼子）而編碼只有41個氨基酸的短肽。本研究中野生毒株表達的X部分只有41個氨基酸，為了探究C端20個氨基酸對古典H1N1亞型豬流感病毒復制和致病能力的影響，我們將野

4、生毒株的PTC進行突變，構建表達全長PA-X的重組質(zhì)粒，拯救PA-X恢復全長的突變毒株，然后通過體內(nèi)外試驗探究20個氨基酸對病毒的影響。研究結果表明：PA-X恢復全長后，病毒在MDCK、A549細胞上的復制能力得到明顯提高，在PK-15細胞上PA-X恢復全長株的復制能力也稍微高于野生株；PA-X恢復全長后，小鼠的體重下降增多，死亡率提高，肺臟病變加重，病毒在肺臟中的復制速度加快，表明C端20個氨基酸對病毒的復制和致病能力起著非常重要的作

5、用；PA-X恢復全長導致病毒的聚合酶活性提高。
　　PB2-627K是決定流感病毒宿主適應性的一個重要因素，研究表明PB2-627K能夠提高禽流感病毒、人流感病毒、古典 H1N1亞型豬流感病毒和三源重組豬流感病毒在小鼠模型上的致病力。豬流感病毒PB2基因的遺傳演化分析結果表明，人源H3N2亞型豬流感病毒PB2基因與古典H1N1和三源重組毒株的遺傳差異均很大，而且關于PB2-627這一位點對于人源H3N2亞型豬流感病毒復制和致病能力

6、的影響，目前國內(nèi)外還沒有相關研究。本研究中，我們首先成功構建了人源H3N2亞型豬流感病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，通過點突變技術將重組質(zhì)粒的PB2-627位由K突變?yōu)镋，進而進行野生株和突變株的拯救，然后通過細胞和小鼠上的試驗比較突變前后病毒的復制和致病能力的變化，研究結果證明：PB2-627位由K突變?yōu)镋后，病毒在MDCK、A549、PK-15細胞上的復制能力明顯下降；在 MDCK細胞上形成的空斑形態(tài)和大小比較結果也證明627K野生株比62