一個罕見多癌家系易感基因的定位與突變篩查的初步研究.pdf

1、癌家族(cancer family)與家族癌(familial aggregated cancerpedigree)不同，其特征表現(xiàn)為不同種類的癌腫在家族中聚集發(fā)生。其發(fā)病機制涉及與多種腫瘤發(fā)生共同相關的腫瘤易感基因群介導的分子改變，參與了腫瘤發(fā)生的早期分子事件。系統(tǒng)尋找和探討它們在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的遺傳學變異，對闡明腫瘤早期發(fā)生機制及尋找腫瘤早期預警、早期診斷和早期治療的分子靶標都具有重要的現(xiàn)實意義。盡管一些實驗室對多癌家系的病例也

2、有報道，但家系中的癌癥患者大多已經死亡，不能為研究提供足夠的遺傳信息，其真正的分子遺傳機制仍不明了。缺少具有研究價值的家系樣本以及缺乏對腫瘤抑瘤＼易感基因群精細定位的高效率研究手段，一直是阻礙多癌家系( multi-cancer pedigree)發(fā)病機制研究的瓶頸。 [一個罕見大多癌家系的搶救性保護與采集] 我們在湖南長沙意外的發(fā)現(xiàn)了一個罕見大多癌家系，包括6代超過103個成員。家系中有患者15人，其中現(xiàn)癥者(affe

3、cted survivals)10人，涉及包括子宮內膜癌(endometrial cancer)、子宮肌瘤( hysteromyoma)、乳腺癌(breast carcinoma)、乳腺纖維瘤(breastfibroids)、結腸癌(colon carcinoma)、直腸癌(rectal cancer)、胃癌( gastric cancer)、血管瘤(hemangioma)、腎囊腫(cyst of kidney)等在內的多種腫瘤。某些患

4、者在他的一生當中多次罹患幾種不同的腫瘤，如II-1先后患有子宮肌瘤和乳腺癌、Ⅳ-1先后患有血管瘤和子宮肌瘤、Ⅳ-3先后患有結腸癌、直腸癌和乳腺纖維瘤、Ⅳ-4患有結腸癌和子宮內膜癌。其中以乳腺、生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的腫瘤占多數(shù)，分別占到總人次的50％和37.5％。10名患者在家系中表現(xiàn)連續(xù)兩代分布，其中男性患者2人，女性患者8人，存在一定的性別差異，但主要還是表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳。家系平均發(fā)病年齡為42.5歲，V-30發(fā)病年齡最早為29歲

5、，II-1發(fā)病年齡最晚為61歲，發(fā)病年齡有逐代提前趨勢，呈遺傳早現(xiàn)( anticipation)現(xiàn)象。 該多癌家系具有人數(shù)多、現(xiàn)癥者多、癌癥種類繁多的特點，屬于非常罕有、珍貴的遺傳資源。其中有的患者已經進入癌癥晚期，生命危在旦夕，為了保全最完整的家系樣本和遺傳信息，我們正爭分奪秒盡全力予以搶救，采集每個樣本時同步進行了外周血永生化淋巴細胞建系(peripheral blood lymphocytes immortalizatio

6、n)。目前，我們己采集了24個核心成員的外周血樣本，其中患者8人，非受累個體10人，外系6人，其平均年齡為44.91±16.80歲(8-73歲)。其中有21例核心家系成員樣本成功完成了外周血永生化淋巴細胞建系，包括患者7人，非受累個體8人，外系6人，為反復深入多癌家系發(fā)病機制研究做好充分準備。完成對該罕見大多癌家系的妥善保護與采集無疑為癌家族復雜的病因學機制研究提供了寶貴、翔實的研究材料，深入其分子遺傳學研究對填補國際領域多癌家系研究方

7、向的空白具有重要的戰(zhàn)略意義和現(xiàn)實意義。 目前，針對疾病基因的定位克隆(positional cloning)策略是疾病家系易感基因研究的有效手段。因此，本文擬通過基于家系的連鎖分析策略，首先，采用高通量SNP芯片對24例多癌家系核心成員進行全基因組掃描、基因分型( genotyping)和連鎖分析(linkageanalysis)，定位該罕見多癌家系的遺傳易感區(qū)段，在此基礎上，進一步采用微衛(wèi)星( Microsatellite，M

8、S)精細掃描定位(fine mapping)、連鎖分析和單體型分析(haplotype analysis)，驗證連鎖；然后，通過基于直接測序的易感基因突變篩查策略，對前期定位的遺傳易感區(qū)段中的候選腫瘤易感基因進行突變篩查，同時針對全基因組范圍的一些具有重要功能的癌基因( Oncogene)、抑癌基因(Tumor suppressorgene)，以及與李凡氏綜合癥、家族性結直腸癌(familial colorectalcancer)和家族

9、性乳腺癌疾病關系密切的基因展開突變篩查(mutationscreen)，以期找到與多癌家系發(fā)病密切相關的基因改變。 基于SNP芯片的全基因組連鎖分析, 首先采用Affymetrix公司包含50萬個單核苷酸多態(tài)(Singlenucleotide polymorphism，SNP)位點的GeneChip() Mapping500K array對多癌家系中的24個核心家系成員進行全基因組掃描( genome-widescan)

10、和基因分型(genotyping)。 根據(jù)Affymetrix公司提供的Gtype軟件進行SNP基因分型，MERLIN軟件用來進行兩點連鎖分析(Two-point linkage analysis)。參數(shù)連鎖分析中，在低嚴謹尺度(low-stringency criteria)下，即良性 腫瘤和惡性腫瘤患者都視為受累個體(affected individuals)，參數(shù)設定為：疾病等位基因頻率(Disease allel

11、e frequency)0.0001，外顯率( Penetrance)為AA=0.95，Aa=0.95，aa=0，發(fā)現(xiàn)染色體3q24-26為LOD值陽性區(qū)段，在SNP-A-2277889-SNP A-19751583之間的SNP位點(位于q24-3 q26.1)的優(yōu)勢對數(shù)(Log odds，LOD)值大于1.0，其中SNP_ A-2219474-SNP A-2106705之間的SNP(位于3q25.31)位點的LOD值達到了最大為2.3

12、82，提示該區(qū)段與多癌家系疾病位點連鎖。在兩點非參數(shù)連鎖分析(Two-point non-parametric linkage analysis)中，染色體同一區(qū)段在SNP A-2053936-SNP A-2308707之間幾個SNP位點(位于3q25.1-3q26.1)的LOD值大于1.0，SNP A-2056580-SNP A-2263975之間的SNP(位于3q25.2-3q25.32)位點的LOD值達到了最大為1.4(p=0.0

13、06)，與參數(shù)連鎖分析結果一致。 隨后對這兩種分析得到的陽性區(qū)段進行連鎖不平衡( LinkageDisequilibrium，LD)建模(modeling)后，參數(shù)連鎖分析LD modeling的結果仍大于2(之前為2.061)，非參數(shù)連鎖分析LD modeling的結果仍大于1(之前為1.12)，排除了位點標記過多導致結果為假陽性的可能。 我們曾嘗試用芯片結果進行多點連鎖分析(multi-piont linkagean

14、alysis)，但都由于數(shù)據(jù)過大，計算量遠遠超出普通計算機的運算能力而被迫放棄。 為了完成多點連鎖分析，同時驗證芯片的結果，本研究針對染色體3q24-26采用微衛(wèi)星進行精細掃描定位。通過查詢MarsMeldclinic數(shù)據(jù)庫，在該區(qū)段一共選擇了19個雜合度(Heterozygosity，H)在0.7以上的微衛(wèi)星位點。對微衛(wèi)星掃描結果進行基因分型，其中有3個位點在家系中雜合度低且分型不好判斷故被舍棄，最終有16個參與了連鎖分析計算

15、。我們選擇了GENEHUNTER軟件進行了兩點及多點的參數(shù)和非參數(shù)連鎖分析，以及Linkage軟件進行兩點參數(shù)連鎖分析。 此外，采用GENEHUNTER軟件和Cyrillic軟件進行家系的單體型分析，從D3S1555-D3S3575的10個位點構成了一個連續(xù)的單體型(4-7-1-10-4-3-5-8-2-9)，在家系中與疾病共分離，其中患者Ⅳ-40、Ⅳ-1、Ⅳ-3、Ⅳ-4、Ⅳ-5、Ⅳ-18、Ⅴ-31、Ⅴ-30和非受累個體Ⅲ-7、

16、Ⅳ-6、Ⅴ-2、Ⅴ-3、Ⅴ-4攜帶共同的單體型。 通過查詢UCSC( University of California Santa Cruz)數(shù)據(jù)庫和基因功能注釋，首批選擇了染色體3q24-26上12個腫瘤相關候選基因，采用基于直接測序的方法進行突變篩查。雖然沒有發(fā)現(xiàn)明確的突變位點，不過目前在AADAC(arylacetamide deacetylase)基因Promoter區(qū)發(fā)現(xiàn)兩個SNP位點rs16833935和rs8193

17、024的特定基因型(分別為tt/tc和gg/ga)與癌家系的腫瘤發(fā)生共分離，兩個SNP的特定基因型在家系患者/攜帶者(patients/carriers)和非攜帶者/外系( non-carrieers/spouse)中的分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=48，p<0.0001)，提示這兩個SNP位點的特定基因型可能與家系腫瘤發(fā)生有重要關系。進一步的研究工作將在當?shù)厝巳褐羞M行這兩個SNP位點的大樣本驗證。同時將采用最新的針對3號染色體的靶向測序