水稻條紋病毒NSvc4與兩個水稻蛋白的互作研究.pdf

1、近年來，水稻條紋葉枯病在各地爆發(fā)流行，給水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。該病害是由水稻條紋病毒(Rice strtpe virus，RSV)引起的。RSV編碼的蛋白主要有外殼蛋白(CP)、病程相關(guān)蛋白(SP)、推測與運(yùn)動相關(guān)的蛋白(NSvc4)等。為了逃避寄主的免疫以及自身的繁殖，病毒蛋白與寄主蛋白之間存在著一系列的互作。在蛋白篩選的基礎(chǔ)上，本研究是對病毒蛋白NSvc4與水稻蛋白之間的相互作用做進(jìn)一步的驗(yàn)證研究。 本文首先對免疫共沉淀

2、在水稻蛋白篩選上的應(yīng)用進(jìn)行探索。一方面，培養(yǎng)水稻懸浮細(xì)胞體系，接種病毒之后提取細(xì)胞總蛋白，分別用CP、SP抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)；另一方面，經(jīng)帶病灰飛虱傳毒之后，提取發(fā)病水稻幼苗總蛋白，分別用SP、CP抗體免疫共沉淀水稻蛋白。分別在水稻懸浮細(xì)胞水平和水稻植株水平，篩選與RSVCP、SP蛋白存在相互作用的水稻蛋白。 在構(gòu)建水稻文庫(武育粳3號和“KT95-418”)的基礎(chǔ)上，分別以RSV CP、SP、NSvc4為誘餌蛋白，通過酵母

3、雙雜交系統(tǒng)，篩選出一系列與病毒蛋白存在相互作用的水稻蛋白。本文對以RSVNSvc4為誘餌蛋白，在“KT95-418”文庫上篩選到的NB8(Heat shock protein DnaJ family protein contains InterPro domain)、NB9(Light regulated Lirl family protein contains InterPro domain)蛋白作為對象，對它們之間的相互作用，做進(jìn)一

4、步的驗(yàn)證研究。 首先，提取水稻RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得了水稻NB8和NB9完整基因，分別將其與酵母雙雜交捕獲載體pGADT7相連，構(gòu)建重組子pGAD-NB8、pGAD-NB9。利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證了NSvc4分別與NB8、NB9蛋白之間的互作情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RSV NSvc4與NB8在三缺平板，四缺平板上均能正常生長。同樣，RSV NSvc4與NB9在三缺平板，四缺平板上也均能正常生長。 為了進(jìn)一步說明水稻條紋

5、病毒RSV NSvc4與水稻蛋白NB8，NB9兩兩之間的互作關(guān)系，本研究又選用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)行檢測。首先通過PCR擴(kuò)增獲得了融合有HA標(biāo)簽的水稻NB8、NB9基因和融合有c-Myc標(biāo)簽的RSVNSvc4基因，并將其分別插入到植物表達(dá)載體pEGAD或pKYLX71:35S2載體中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105后注射本氏煙(Nicotianabenthamiana)。提取煙草中瞬時表

6、達(dá)的蛋白，以HA抗體或c-Myc抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，最后免疫混合物通過c-Myc抗體或HA抗體進(jìn)行Western blot檢測，確定蛋白的互作情況。結(jié)果表明，RSVNSvc4蛋白與NB8能夠發(fā)生互作，而NSvc4與NB9蛋白之間未檢測到互作現(xiàn)象。 最后，本研究利用熒光定量PCR技術(shù)，對NB8、NB9基因，在水稻病葉和水稻健葉中mRNA表達(dá)量的情況分別做了檢測。NB8在水稻病葉中mRNA表達(dá)量與水稻健葉含量相比較沒有明顯變化，