水稻條紋病毒(RSV)編碼的SP蛋白的結(jié)構(gòu)與功能初探.pdf

1、水稻是目前世界人口最重要的糧食作物之一，但是，水稻因?yàn)楦鞣N各樣的病蟲害導(dǎo)致的產(chǎn)量下降卻屢見(jiàn)不鮮，其中包括嚴(yán)重影響我國(guó)水稻產(chǎn)量的一種單鏈RNA病毒----水稻條紋病毒（Rice stripe virus， RSV）。文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，水稻條紋病毒主要侵染水稻、煙草、甚至玉米等的葉片，使葉片出現(xiàn)枯色條紋狀病變。關(guān)于水稻條紋病毒如何作用于宿主植物，包括，病毒蛋白如何通過(guò)宿主發(fā)揮其毒害作用的機(jī)制還不清楚。因此，開(kāi)展關(guān)于水稻條紋病毒蛋白與宿主水稻蛋白

2、之間的互作關(guān)系的研究具有十分重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，水稻條紋病毒的第四條RNA鏈正向控制編碼的一種致病特異蛋白（disease-specific protein，SP）可能是參與病毒侵染植物，發(fā)揮其致病作用的一種關(guān)鍵蛋白。
　　本研究以該蛋白為重點(diǎn)，以期解析其結(jié)構(gòu)；通過(guò)尋找該蛋白作用于宿主水稻的靶標(biāo)蛋白，解析互作復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，從而分析其可能的致病機(jī)理。首先，論文采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，體外表達(dá)SP蛋白，利用親和純化的方法，純化獲得該蛋

3、白，并以期得到該蛋白的晶體，然后優(yōu)化出最佳衍射數(shù)據(jù)的晶體，從而解析該蛋白的分子結(jié)構(gòu)，分析其可能與宿主靶標(biāo)蛋白互作的結(jié)構(gòu)域或蛋白序列。其次，以新鮮的水稻葉片為材料，進(jìn)行葉片全蛋白的提取，并將SP蛋白與MBP標(biāo)簽和GST標(biāo)簽融合表達(dá)。最后，利用pull-down技術(shù)，將純化好的含有不同標(biāo)簽的SP蛋白與水稻葉片全蛋白進(jìn)行孵育后，除去非特異性結(jié)合的雜蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，銀染顯色，核磁鑒定互作蛋白的序列，并以期獲得二者互作的晶體結(jié)構(gòu)，

4、分析互作的關(guān)鍵位點(diǎn)。結(jié)果顯示：體外表達(dá)獲得了大量的純度較高的SP蛋白；戊二醛交聯(lián)實(shí)驗(yàn)標(biāo)明該蛋白可能存在通過(guò)自身互作形成三聚體；報(bào)道稱發(fā)現(xiàn)SP可與水稻葉綠體光合作用復(fù)合體Ⅱ中的PsbP蛋白互作，但根據(jù)等溫滴定量熱法（ITC）測(cè)定二者互作關(guān)系，未顯示其可明顯發(fā)生互作；有報(bào)道標(biāo)明，SP可能與某些短肽互作，但I(xiàn)TC結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有明顯的互作關(guān)系；目前還未得到該蛋白的晶體衍射數(shù)據(jù)；該蛋白與水稻葉片全蛋白的pull-down結(jié)果還未發(fā)現(xiàn)特異的互作蛋白。