水稻條紋病毒NSvc2-N與NSvc2-C蛋白互作的研究.pdf

1、水稻條紋病毒（RSV）是最重要的水稻病毒之一，可引起水稻條紋葉枯病，給水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。該病毒主要由介體灰飛虱（Laodelphax steiatellus）以循回增殖的方式傳播，灰飛虱一旦染毒可以持久傳毒，并且可經(jīng)卵傳遞給下一代幼蟲，因此給防治工作帶來了困難。
　　RSV隸屬于纖細(xì)病毒屬（Tenuivius），是該屬的典型成員，其基因組由4條單鏈RNA組成，共編碼7種蛋白質(zhì)。其中NSvc2蛋白由RSV RNA2的反義鏈編

2、碼，分子量為94kDa。因為NSvc2蛋白分子量比較大，翻譯后要經(jīng)歷復(fù)雜的修飾過程，并且可能具細(xì)胞毒性，因此造成了它的研究困難。相對RSV編碼的其它蛋白，NSvc2相關(guān)的研究工作開展較少。NSvc2蛋白可以在病株和灰飛虱中檢測到，暗示NSvc2蛋白可能在介導(dǎo)病毒傳播及誘導(dǎo)宿主植物癥狀的發(fā)生中起作用，是一個重要的多功能蛋白。另外，我們前期的研究結(jié)果表明NSvc2蛋白在宿主細(xì)胞中被切割成兩部分(NSvc2-N和NSvc2-C)，這兩部分之間

3、可能存在互作?；谇捌诘难芯拷Y(jié)果，本文對NSvc2-N和NSvc2-C間的互作展開研究，從而為深入研究NSvc2蛋白的結(jié)構(gòu)、在病毒侵染、致病及傳播過程中所起的作用奠定基礎(chǔ)，為控制病害的發(fā)生提供一定理論依據(jù)。
　　第一章以綜述的形式論述了RSV的研究概況，包括其危害、分類、基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的功能。另外，簡單介紹了本實驗所用到的幾種實驗技術(shù)，如:酵母雙雜交、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等技術(shù)的原理及其優(yōu)缺點。另外，還介紹了利用桿狀病毒AcM

4、NPV作為人類干細(xì)胞基因治療載體的相關(guān)內(nèi)容，對桿狀病毒的結(jié)構(gòu)和功能及桿狀病毒表達載體系統(tǒng)的相關(guān)技術(shù)進行了簡單介紹。
　　第二章利用酵母雙雜交系統(tǒng)來驗證NSvc2-N和NSvc2-C蛋白間的互作。構(gòu)建分別含編碼NSvc2-N和NSvc2-C基因片段的酵母雙雜交載體，進而驗證兩者間的互作。結(jié)果顯示，含NSvc2-N和NSvc2-C基因片段的酵母在含有X-α-gal四缺培養(yǎng)基上出現(xiàn)了明顯的藍斑，表明NSvc2-N和NSvc2-C蛋白間存

5、在互作。
　　第三章利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)來進一步驗證NSvc2-N和NSvc2-C蛋白間的互作。通過原核表達載體成功構(gòu)建出NSvc2蛋白的N端和C的一些片段，將其導(dǎo)入昆蟲Sf9細(xì)胞中，利用共聚焦顯微鏡來觀察它們之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)它們之間發(fā)生了FRET，表明存在相互作用。
　　第四章利用桿狀病毒AcMNPV載體將綠色熒光蛋白（GFP）和人生長因子（HGF）基因轉(zhuǎn)入兔子骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)中表達。PCR擴增eGF

6、P和HGF基因片段，克隆于原核表達載體得到重組質(zhì)粒pFast-Tet-egfp和pFast-Tet-hgf,利用Bac-to-Bac系統(tǒng)獲得Ac-eGFP和Ac-HGF Bacmid DNA，將其轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞獲得重組的桿狀病毒vAcrtTA2-Ptight-GFP和vAcrtTA2-Ptight-HGF。
　　第五章對本文進行了總結(jié)和分析。
　　綜上所述，本論文對RSV NSvc2-N和NSvc2-C蛋白間互作用進行了