靶向DNA修復(fù)基因增加腫瘤放射治療敏感性.pdf

1、研究背景：
　　 放射治療是目前腫瘤臨床綜合治療的重要手段之一，大約50％以上的腫瘤患者需要接受放射治療，然而腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的放射抵抗性和放射治療后腫瘤細(xì)胞再增殖是腫瘤放射治療的主要障礙，極大地限制了放射治療的潛在價(jià)值。因此增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性和抑制腫瘤細(xì)胞的再增殖能夠有效地提高腫瘤放射治療的臨床效果。
　　 放射治療殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制是基因組DNA雙鏈斷裂(Double Strand Breaks，DSBs)，導(dǎo)

2、致細(xì)胞失去增殖能力，然而腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的DNADSBs修復(fù)能力，直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的放射抵抗性。同源重組(Homologous Recombination，HR)和非同源末端連接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞修復(fù)DNADSBs的兩個(gè)分子通路，調(diào)控DNADSBs修復(fù)通路的關(guān)鍵蛋白能夠增強(qiáng)腫瘤放射治療的敏感性。XRCC2和XRCC4基因分別是HR和NHEJ修復(fù)通路的關(guān)鍵蛋白，兩者可能是調(diào)控腫

3、瘤放射敏感性的重要靶點(diǎn)。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是由約19～23個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，通過不完全的堿基配對(duì)識(shí)別靶基因3'端非翻譯區(qū)，降解靶基因信使RNA(messengerRNA，mRNA)或（和）阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯。由于人工合成的miRNA(artificialmi RNA，amiRNA)能夠減輕短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，近年來已廣泛地

4、應(yīng)用于特異性沉默靶基因的表達(dá)及其功能研究?；赼miRNA的RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)已經(jīng)成為腫瘤靶向性治療的基本工具，并有望成為腫瘤治療和臨床研究的一種新策略。
　　 第一部分，RNAi靶向DNA修復(fù)基因編碼與非編碼序列增敏放療
　　 目的:
　　 構(gòu)建靶向HR和NHEJ修復(fù)通路關(guān)鍵蛋白XRCC2和XRCC4的amiRNAs，研究特異性amiRNAs對(duì)腫瘤細(xì)胞XRCC2和XRCC

5、4基因的抑制作用，并觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞放射敏感性的影響;應(yīng)用amiRNA和siRNA聯(lián)合靶向XRCC2和XRCC4的非編碼序列和編碼序列，觀察是否能夠更有效地抑制基因表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，并且分析其抑制基因表達(dá)的作用機(jī)制，旨在探討以XRCC2和XRCC4為靶點(diǎn)的腫瘤放射增敏治療的可行性，以及amiRNA和siRNA聯(lián)合介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)特異性沉默基因表達(dá)的有效性。
　　 方法和材料:
　　 根據(jù)BLOCK-

6、iTTMPolⅡmiRRNAi表達(dá)體系，設(shè)計(jì)并合成靶向XRCC2和XRCC4非編碼序列的特異性互補(bǔ)DNA寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA寡核苷酸，應(yīng)用Gateway技術(shù)重組入pLenti6/V5-DEST載體，構(gòu)建amiRNA表達(dá)質(zhì)粒pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR;熒光素酶分析amiR-XRCC2和amiR-XRCC4與靶基因非編碼序列結(jié)合的特異性;與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收集上清，利用慢病毒介導(dǎo)amiRNA表達(dá)

7、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG和肺癌細(xì)胞A549，通過Westernblot檢測XRCC2和XRCC4的蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證amiRNA作用的有效性?？股谺lasticidin篩選穩(wěn)定表達(dá)amiR-XRCC2和amiR-XRCC4的U87MG和A549細(xì)胞，給予不同劑量X射線照射，通過細(xì)胞免疫熒光方法檢測γ-H2AX表達(dá)變化觀察DNA雙鏈斷裂的修復(fù)，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測amiRNA抑制XRCC2和XRCC4基因?qū)δ[瘤細(xì)胞放射敏感性的影響

8、。利用XRCC2和XRCC4的特異性siRNA，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)amiR-XRCC2和amiR-XRCC4的U87MG和A549細(xì)胞72小時(shí)，通過Westernblot檢測其對(duì)XRCC2和XRCC4蛋白表達(dá)的影響，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測amiRNA表達(dá)質(zhì)粒與siRNA聯(lián)合抑制XRCC2和XRCC4基因表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞放射敏感性的影響;合成針對(duì)XRCC2和XRCC4的特異性amiRNAmimic，與siRNA共轉(zhuǎn)染U87MG和A549細(xì)胞72h后，應(yīng)

9、用實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot檢測XRCC2和XRCC4的mRNA和蛋白水平，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測兩者共轉(zhuǎn)染聯(lián)合抑制XRCC2和XRCC4基因?qū)δ[瘤細(xì)胞放射敏感性的影響。
　　 結(jié)果:
　　 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肺癌中DNA修復(fù)基因XRCC2與XRCC4的表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞和組織;構(gòu)建的amiR-XRCC2與amiR-XRCC4能夠分別特異性地作用于基因的3'非編碼序列，并分別有效地抑制U87MG和A549腫瘤細(xì)胞中

10、XRCC2與XRCC4基因的表達(dá)，從而增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，而且兩者聯(lián)合作用的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)作用;amiR-XRCC2和amiR-XRCC4轉(zhuǎn)染U87MG和A549后細(xì)胞的生長增殖速率無明顯改變;與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染amiR-Vector的U87MG和A549細(xì)胞對(duì)照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染amiR-XRCC2或amiR-XRCC4的細(xì)胞經(jīng)X射線照射30min后，兩組細(xì)胞中γ-H2AX的陽性率明顯高于對(duì)照組，但該兩組細(xì)胞之間的陽性率無明顯區(qū)別

11、，而聯(lián)合轉(zhuǎn)染amiR-XRCC2和amiR-XRCC4細(xì)胞中γ-H2AX的陽性率明顯高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染amiR-XRCC2或者amiR-XRCC4的細(xì)胞。XRCC2或XRCC4特異性siRNA轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)amiR-XRCC2或amiR-XRCC4的U87MG和A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)對(duì)XRCC2和XRCC4蛋白水平的抑制作用最明顯，而且siRNA轉(zhuǎn)染后能夠有效地增加穩(wěn)定表達(dá)amiR-XRCC2和（或）amiR-XRCC4細(xì)胞的放射敏感性。

12、化學(xué)合成XRCC2和XRCC4的特異性amiRmimics，分別與XRCC2和XRCC4的特異性siRNA共轉(zhuǎn)染U87MG和A549細(xì)胞，兩種小RNA的聯(lián)合應(yīng)用能更有效地抑制蛋白表達(dá)并增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。與siRNA轉(zhuǎn)染組比較，amiRmimic轉(zhuǎn)染組中XRCC2和XRCC4基因的蛋白抑制水平(～70％)無明顯區(qū)別，但其mRNA表達(dá)水平明顯低于前者(～30％VS～65％);與siRNA轉(zhuǎn)染組比較，amiRmimic與siRNA聯(lián)合

13、轉(zhuǎn)染能更有效地減少蛋白表達(dá)，但并不進(jìn)一步降低mRNA的穩(wěn)定性，說明amiRmimic能同時(shí)通過降低mRNA穩(wěn)定性和阻斷蛋白翻譯來抑制基因的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 抑制腫瘤細(xì)胞中DNA修復(fù)蛋白XRCC2和XRCC4的表達(dá)，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞DNA的X射線損傷作用，并有效地增加腫瘤細(xì)胞對(duì)X射線治療的敏感性。聯(lián)合amiRNA和siRNA的小RNA干擾技術(shù)分別靶向XRCC2與XRCC4的非編碼區(qū)和編碼區(qū)能更有效地抑制蛋白表達(dá)并增

14、強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。從機(jī)制上來講，該聯(lián)合基因沉默方法是通過降低靶基因mRNA的穩(wěn)定性和阻遏蛋白質(zhì)的翻譯兩條途徑抑制靶基因的表達(dá)。本研究建立了一種更加有效的基因沉默方法，尤其適用于抑制應(yīng)用amiRNA或者siRNA干擾難以沉默的基因。
　　 第二部分，重離子輻射和人工miRNA聯(lián)合靶向同源重組修復(fù)基因有效殺傷腫瘤細(xì)胞
　　 目的:
　　 與常規(guī)射線放療相比，重離子放療因其物理學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)優(yōu)勢使其成為腫瘤放射治

15、療領(lǐng)域最理想的放療方法。重離子束照射細(xì)胞后，沿自身軌跡產(chǎn)生致密電離造成細(xì)胞無法修復(fù)的集簇性DNA損傷，并且改變細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，而這些大量集簇性的小的DNA片段干擾非同源末端連接修復(fù)，但不影響同源重復(fù)修復(fù)。重離子輻射治療腫瘤臨床試驗(yàn)的優(yōu)異療效，促使重離子治療與其他治療方式的聯(lián)合治療越來越受到關(guān)注，尤其是與分子靶向治療以及化學(xué)制劑相結(jié)合，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。前期研究中我們構(gòu)建的靶向抑制DNA雙鏈斷裂修復(fù)基因XRCC2和XRCC4的amiR

16、NA可有效地抑制其在腫瘤細(xì)胞中的蛋白表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)X射線的敏感性。鑒于此，本研究將采用amiR-XRCC2抑制同源重組修復(fù)通路聯(lián)合重離子輻射治療觀察是否能夠能加有效地殺死腫瘤細(xì)胞。
　　 方法和材料:
　　 體外培養(yǎng)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞，以及穩(wěn)定表達(dá)amiR-Vector、amiR-XRCC2、amiR-XRCC4和amiR-XRCC2/XRCC4的U87MG和A549細(xì)胞。皮下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)

17、染amiRNA的腫瘤細(xì)胞構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。對(duì)細(xì)胞和移植瘤分別給予低LET和高LET射線照射。低LET照射是采用X射線，輸入電壓320V，輸入電流10mA，細(xì)胞照射劑量率為2Gy/min，移植瘤照射劑量率為1Gy/min。高LET照射是采用Fe離子束，能量為1GeV/amu，細(xì)胞和移植瘤照射劑量率為1Gy/min。細(xì)胞射線照射后通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。移植瘤射線照射治療后一周，處死裸鼠，取瘤稱重，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)方

18、法檢測移植瘤中XRCC2和XRCCR4的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 與amiR-Vector組相比，amiR-XRCC2和amiR-XRCC4組U87MG和A549細(xì)胞對(duì)低LET射線的敏感性增強(qiáng)，amiR-XRCC2組腫瘤細(xì)胞對(duì)高LET射線的敏感性增強(qiáng)，而amiR-XRCC4組腫瘤細(xì)胞對(duì)高LET射線的敏感性無明顯改變。與amiR-XRCC2組相比，amiR-XRCC2/4組細(xì)胞對(duì)低LET射線的敏感性增強(qiáng)，而對(duì)高LET

19、射線的敏感性無明顯改變。與XRCC4組比較，amiR-XRCC2/XRCC4組細(xì)胞對(duì)低LET和高LET射線的敏感性均增強(qiáng)。低LET與高LET射線照射均能夠縮小腫瘤體積，而且后者較前者的體積更小。X射線照射后，amiR-XRCC2和amiR-XRCC4組腫瘤的體積明顯小于空載體組，而重離子束照射后，amiR-XRCC2組腫瘤的體積明顯小于空載體組，而amiR-XRCC4組腫瘤的體積與空載體組比較無明顯差別。與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似，與amiR

20、-XRCC2或amiR-XRCC4組相比，amiR-XRCC2/XRCC4組腫瘤體積經(jīng)低LET射線照射后明顯縮小，與amiR-XRCC2組比較，amiR-XRCC2/XRCC4組腫瘤體積經(jīng)高LET射線照射后無明顯改變。
　　 結(jié)論:
　　 抑制非同源末端連接修復(fù)蛋白XRCC4和同源重組修復(fù)蛋白XRCC2能夠在體外和體內(nèi)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)低LET射線的敏感性，而且抑制XRCC2而非XRCC4能夠有效地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)高LET照射