RNA干擾阻斷STAT3基因?qū)δ[瘤細(xì)胞放射敏感性的影響.pdf

1、是腫瘤臨床治療的一種重要手段，腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期調(diào)控等最基本的生命活動(dòng)密切相關(guān)。近年來，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)阻斷、導(dǎo)入和修飾腫瘤細(xì)胞某些信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，促進(jìn)電離輻射誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞死亡和凋亡，進(jìn)而提高放療效果，并最大限度減少正常組織細(xì)胞損傷的方法已成為腫瘤放射治療研究的熱點(diǎn)之一。 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(SignalTransducerandActivatoro

2、fTranscription3，STAT3)是一種存在于細(xì)胞漿與酪氨酸磷酸化信號(hào)通路相耦聯(lián)的具有關(guān)鍵作用的雙功能蛋白。激活后形成二聚體轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，識(shí)別并結(jié)合到靶基因DNA特異的反應(yīng)元件，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)。目前研究表明STAT3在腫瘤的形成和發(fā)展過程中起著重要的作用。 本文主要研究RNA干擾(RNAinterference，RNAi)阻斷腫瘤細(xì)胞STAT3后，腫瘤輻射敏感性的變化。 研究?jī)?nèi)容選取S

3、TAT3高表達(dá)的體外培養(yǎng)人類腫瘤細(xì)胞作為研究對(duì)象，檢測(cè)其胞內(nèi)STAT3蛋白的表達(dá)及其磷酸化活化水平； 合成STAT3小干擾RNA(short/smallinterferencingRNA)：采用文獻(xiàn)報(bào)道的人類STAT3小干擾RNA序列，化學(xué)合成； 研究STAT3小干擾RNA對(duì)人類腫瘤細(xì)胞STAT3基因mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響以及蛋白磷酸化的影響； 觀察STAT3小干擾RNA轉(zhuǎn)染后體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的變

4、化并探討其可能的作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法用Real-timeRT-PCR和WesternBlot技術(shù)研究人肝癌HepG-2細(xì)胞中STAT3的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)及磷酸化活化水平；脂質(zhì)體包裹STAT3小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過Real-timeRT-PCR和WesternBlot技術(shù)分別在mRNA水平和蛋白水平上檢測(cè)STAT3的表達(dá)和/或磷酸化活化水平；研究RNA干擾阻斷STAT3后體外培養(yǎng)人肝癌HepG-2細(xì)胞放射敏感性的變化：

5、采用CCK-8(CellCountingKit8)法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化；利用Hoechst33258染色對(duì)各種處理因素作用后的細(xì)胞作形態(tài)學(xué)觀察，判別凋亡細(xì)胞數(shù)量變化的趨勢(shì)，研究STAT3小干擾RNA對(duì)HepG-2細(xì)胞放射敏感性的影響，觀察RNA干擾和電離輻射的協(xié)同效應(yīng)；選取人皮膚成纖維細(xì)胞系HSF作為對(duì)照進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)于HSF細(xì)胞株，人肝癌HepG-2細(xì)胞株中STAT3蛋白高水平表達(dá)且有一定程度的磷酸化水

6、平升高。 一定濃度siRNA轉(zhuǎn)染后，處理組STAT3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平、總蛋白表達(dá)及其磷酸化水平發(fā)生明顯降低。 人肝癌HepG-2細(xì)胞株中RNA干擾阻斷STAT3后，其放射敏感性顯著增強(qiáng)：CCK-8檢測(cè)表明與對(duì)照組相比，單純siRNA轉(zhuǎn)染可使腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出增殖力下降，而siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合輻射作用腫瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制；DNA染色劑Hoechst33258染色后的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明單純siRNA轉(zhuǎn)染組并未出現(xiàn)明顯增多的細(xì)

7、胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，但siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合輻射作用后呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)的細(xì)胞出現(xiàn)頻率顯著增加；而作為對(duì)照的正常細(xì)胞中沒有觀察到明顯的放射敏感性增加。 討論正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中STAT3的激活是快速而短暫的，STAT3異常高水平表達(dá)和持續(xù)性激活與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程密切相關(guān)。STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通道匯聚的焦點(diǎn)，在多種腫瘤細(xì)胞和組織中都有異常激活。本實(shí)驗(yàn)室已有研究表明，在鼠惡性黑色素瘤B16

8、細(xì)胞株、人肝癌SMMC-7721、HepG-2細(xì)胞株、人肺癌細(xì)胞A549及人子宮癌Hela細(xì)胞株中均可檢測(cè)到STAT3蛋白的高度表達(dá)和磷酸化活化。STAT3激活后將誘導(dǎo)一些與細(xì)胞增殖、分化、生存及凋亡等密切相關(guān)的關(guān)鍵基因的異常表達(dá)，通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化和血管形成并阻礙細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出致癌的作用以及對(duì)放療、化療等細(xì)胞毒性治療的抵抗。 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)STAT3的siRNA序列能夠特異性的和有效的抑制體外培養(yǎng)的人肝癌

9、HepG-2細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)和磷酸化活化，聯(lián)合應(yīng)用STAT3小干擾RNA及電離輻射后，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較單純應(yīng)用電離輻射更強(qiáng)的增殖抑制，出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)的細(xì)胞明顯增多；同時(shí)，作為對(duì)照的正常細(xì)胞(人皮膚成纖維細(xì)胞株HSF)中沒有觀察到明顯增強(qiáng)的放射敏感性。我們的研究表明，采用RNA干擾技術(shù)阻斷腫瘤細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)和活化有可能成為一種提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性和腫瘤放射治療療效的方法，具有一定的臨床應(yīng)用前景。 以

10、往的研究表明STAT3的激活能夠使VEGF表達(dá)上調(diào)，阻斷STAT3信號(hào)通道，其下游基因Bcl-xL、Mcl-l、c-Myc、cyclinD1也發(fā)生下調(diào)，而這些基因與腫瘤細(xì)胞的異常增殖、凋亡抵抗以及放射不敏感性有關(guān)。STAT3特異性的小干擾RNA轉(zhuǎn)染后有效的降低人肝癌HepG-2細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)和活化水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能是阻斷STAT3蛋白的表達(dá)和活化引起一系列和細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡等相

11、關(guān)的基因如Bcl-xL、Mcl-l、c-Myc、cyclinD1、VEGF、P53等的表達(dá)水平改變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖抑制。RNA干擾與輻射聯(lián)合作用后，可以提高輻射引起的腫瘤細(xì)胞凋亡。另有研究表明，相對(duì)于一些正常細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞對(duì)STAT3的持續(xù)性高水平表達(dá)和激活的依賴性似乎更強(qiáng)，這與我們的研究結(jié)果是相符合的。腫瘤細(xì)胞對(duì)STAT3的這種依賴性為阻斷STAT3后的放射治療提供了一定的腫瘤細(xì)胞特異性，可能提供一種在不增加正常組織放射治