zkscan3基因敲除小鼠模型的研究和EGFR分子轉(zhuǎn)磷酸化機理的研究.pdf

1、本文對zkscan3基因敲除小鼠模型的研究和EGFR分子轉(zhuǎn)磷酸化機理進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：
　　目的：ZKSCAN3(人源)是一個新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子,前期研究發(fā)現(xiàn)該基因在結(jié)腸癌的形成過程中起著一定的作用,ZKSCAN3在侵襲性結(jié)腸癌細胞和其肝臟轉(zhuǎn)移病灶中過度表達,但在鄰近的非轉(zhuǎn)化組織中表達程度很低,但是,至今為止還沒有系統(tǒng)的ZKSCAN3基因正常生理功能研究的報告,鑒于其在自噬、腫瘤病理生物學(xué)中的重要

2、作用,通過zkscan3(鼠源)基因敲除小鼠模型來確定其正常的生理功能就具有十分重要的意義。
　　方法：⑴通過CRE雜交系統(tǒng)敲除野生型小鼠的zkscan3基因的2號外顯子,并對敲除小鼠的后代做基因型鑒定。⑵采用RT-PCR方法半定量zkscan3基因在野生型小鼠各個器官的表達情況,為進一步研究做好前期準備。⑶定量PCR,使用定量PCR進一步對zkscan3的敲除結(jié)果進行驗證,同時使用定量精確分析zkscan3在小鼠胚胎成纖維細胞以

3、及成年小鼠各個器官中的表達情況。⑷使用流式細胞分析技術(shù)分析成年野生型小鼠和zkscan3敲除小鼠胸腺CD3+細胞及脾臟中CD3+、CD4+、CD8+細胞百分比含量的差別。⑸分別用zkscan3敲除小鼠和野生型小鼠的CDNA進行 Microarray分析,找出與zkscan3功能相關(guān)的基因。⑹對小鼠進行人工抗原卡介苗刺激,檢測小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答曲線,并檢測小鼠血液指標。
　　結(jié)果：①對雜交新生小鼠的基因鑒定結(jié)果顯示,zkscan3基因

4、的2號外顯子確實被敲除。②對小鼠各個器官進行 RT-PCR結(jié)果顯示,zkscan3在小鼠不同器官中表達存在明顯差異,尤其在卵巢、睪丸以及胸腺中高表達。③定量PCR結(jié)果顯示,zkscan3基因2號外顯子確實被敲除;而且zkscan3基因在野生型小鼠的不同器官中存在差異性表達,尤其在胃、卵巢、脾臟、前列腺和脾臟中高表達。④流式細胞分析發(fā)現(xiàn),敲除小鼠胸腺中CD3+淋巴細胞數(shù)量上比在野生型小鼠中有顯著的升高;同時在脾臟中,CD4+淋巴細胞和CD

5、8+淋巴細胞的細胞數(shù)量也比在野生型有顯著升高。⑤Microarray結(jié)果顯示,敲除zkscan3后,表達發(fā)生顯著變化的基因主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)。⑥對小鼠進行抗原免疫刺激后,發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比,zkscan3基因敲除小鼠的免疫應(yīng)答出現(xiàn)紊亂,血液檢測指數(shù)顯示,zkscan3基因敲除小鼠小鼠可能出現(xiàn)貧血癥狀。
　　結(jié)論：研究結(jié)果顯示,zkscan3基因在小鼠體內(nèi)可能是一個復(fù)雜的調(diào)控基因,根據(jù)已有數(shù)據(jù)推斷,zksca

6、n3很可能對免疫系統(tǒng)起到抑制的作用,在小鼠體內(nèi)我們發(fā)現(xiàn),它的敲除會導(dǎo)致小鼠免疫功能的上升,并且會造成免疫系統(tǒng)對外來抗原刺激的免疫應(yīng)答紊亂,同時也會對神經(jīng)系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。
　　第二部分：
　　目的：表皮生長因子受體(EGFR),一個眾所周知的致癌蛋白,在細胞生長、細胞周期和許多癌癥疾病中起著重要的作用。雖然表皮生長因子受體的二聚化被認為是表皮生長因子受體激活的一個主要途徑,但是有關(guān)表皮生長因子受體被激活之后,表皮生長

7、因子受體之間如何相互作用進行轉(zhuǎn)磷酸化以及自身磷酸化仍然不為所知。所以進一步研究EGFR在Y845位轉(zhuǎn)磷酸化作用以及其自身磷酸化激酶活性將為EGFR活化及功能調(diào)節(jié)機制提供新的見解。
　　方法：⑴免疫沉淀和免疫印跡；⑵體外激酶實驗；⑶體外轉(zhuǎn)磷酸化實驗；⑷轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達EGFR細胞株的建立；⑸細胞生長實驗；⑹體外DNA摻入實驗。
　　結(jié)果：EGFR分子845位的酪氨酸轉(zhuǎn)磷酸化會影響其自身自磷酸化；EGFR分子845位的酪氨酸突變后

8、,轉(zhuǎn)磷酸化作用缺陷的分子激酶活性消失；EGFR分子845位酪氨酸突變后,對其二聚體的磷酸化作用消失；EGFR分子845位酪氨酸突變后,其刺激細胞生長和DNA合成的能力下降。
　　結(jié)論：表皮生長因子受體EGFR,其845位酪氨酸的轉(zhuǎn)磷酸化作用與表皮生長因子受體的子磷酸化作用以及激酶活性有關(guān)。當(dāng)將表皮生長因子受體845位的酪氨酸替換為苯丙氨酸后,它對配體刺激作用的生物學(xué)反應(yīng)消失,這說明了這一轉(zhuǎn)磷酸化位點對其功能的重要性。所以,我們的研