2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、高血壓腦卒中是我國(guó)發(fā)病率高、危害大的心腦血管疾病。腦血管重構(gòu)是腦卒中一個(gè)關(guān)鍵的病理變化。平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡是腦血管重構(gòu)的重要因素。本文旨在研究血管平滑肌細(xì)胞ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點(diǎn)及激活機(jī)理。實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分:
   第一章:ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點(diǎn)鑒定。
   本部分首先采用免疫沉淀的方法研究低滲刺激下ClC-3蛋白酪氨酸磷酸化變化情況。結(jié)果表明:
   ⑴穩(wěn)定表達(dá)HA與ClC-3融

2、合蛋白(HAClC-3)的A10細(xì)胞用低滲液和等滲液分別處理90s后,用antiHA antibody將HAClC-3融合蛋白免疫沉淀,用antiphosphotyrosine antibody進(jìn)行免疫印跡。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與等滲處理90s相比,低滲刺激90s后HAClC-3蛋白的酪氨酸磷酸化水平明顯增強(qiáng)。
   ⑵經(jīng)系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析ClC-3蛋白序列后發(fā)現(xiàn),在ClC-3蛋白上主要存在3個(gè)酪氨酸殘基位點(diǎn)可能發(fā)生磷酸化,分別為接近N

3、端284位酪氨酸殘基(Y284),位于C端的572和631位酪氨酸殘基(Y572和Y631)。
   ⑶Y631F突變對(duì)表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流的性質(zhì)(整流性和電壓依賴性和時(shí)間依賴性失活)沒(méi)有明顯影響。經(jīng)單因素方差分析,A10組、GFP空載體組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y631F突變體組在等滲和低滲時(shí)±80mV的電流密度均有明顯差異(p<0.05)。
   ⑷經(jīng)單因素方差分析,A10組、GFP空載體組、GFP

4、ClC-3組、GFPClC-3Y631F突變體組在等滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度沒(méi)有明顯差異(p>0.05),而在低滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度有明顯差異(p<0.05)。
   ⑸Y572F突變對(duì)表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流的性質(zhì)(整流性和電壓依賴性和時(shí)間依賴性失活)沒(méi)有明顯影響。經(jīng)單因素方差分析,A10組、GFP空載體組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y572F突變體組在等滲和低滲時(shí)±80mV的電流密度均有明顯差異(p<0.05)。
  

5、⑹經(jīng)單因素方差分析,A10組、GFP空載體組、GFP ClC-3組、GFPClC-3Y572F突變體組在等滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度沒(méi)有明顯差異(p>0.05),而在低滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度有明顯差異(p<0.05)。
   ⑺經(jīng)單因素方差分析,A10組、GFP空載體組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y284F突變體組在等滲和低滲時(shí)±80mV的電流密度均有明顯差異(p<0.05)。
   ⑻經(jīng)單因素方差分析,A10組、GFP空載體

6、組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y284F突變體組在等滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度沒(méi)有明顯差異(P>0.05),而在低滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度有明顯差異(p<0.05)。
   ⑼Y631Y572F突變對(duì)表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流的性質(zhì)(整流性和電壓依賴性和時(shí)間依賴性失活)沒(méi)有明顯影響。
   小結(jié):①低滲刺激后ClC-3蛋白酪氨酸磷酸化水平增加。②應(yīng)用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ClC-3蛋白主要存在三個(gè)酪氨酸殘基可能發(fā)生磷酸化,分別是Y284

7、,Y572,Y631。③Y631F突變對(duì)容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯電流和容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯運(yùn)動(dòng)沒(méi)有明顯影響。④Y572F突變可以減弱容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯電流和容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯運(yùn)動(dòng)。⑤Y284F突變顯著減弱容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯電流和容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯運(yùn)動(dòng)。⑥Y631FY572F雙位點(diǎn)突變體表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流與Y631F單突變體表達(dá)電流相比有明顯差異,而與Y572F單突變體表達(dá)電流相比沒(méi)有明顯差異。⑦Y631FY284F雙

8、位點(diǎn)突變體表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流與Y631F單突變體表達(dá)電流相比有明顯差異,而與Y284F單突變體表達(dá)電流相比沒(méi)有明顯差異。⑧Y572FY284F雙位點(diǎn)突變體表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流與Y572F單突變體表達(dá)電流相比有明顯差異,而與Y284F單突變體表達(dá)電流相比沒(méi)有明顯差異。⑨Y631FY572FY284F三位點(diǎn)突變體表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流與Y631F單突變體表達(dá)電流相比有明顯差異,與Y572F單突變體表達(dá)電流相比也有明顯差異,而與Y284

9、F單突變體表達(dá)電流相比沒(méi)有明顯差異。⑩Y284D突變顯著增強(qiáng)容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯電流和容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯運(yùn)動(dòng)。
   第二章:功能位點(diǎn)突變對(duì)ClC-3氯通道保護(hù)細(xì)胞凋亡作用的影響。
   通過(guò)在A10細(xì)胞上轉(zhuǎn)染Y284F,Y284D兩種ClC-3突變體和正常ClC-3 cDNA,運(yùn)用核Hoechst染色及Anexin V和PI雙染技術(shù),研究突變對(duì)容積調(diào)節(jié)性ClC-3通道保護(hù)TG和H2O2誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的功能的

10、影響。結(jié)果如下:
   ⑴分別用25μM,50μM,100μM,200μMTG處理A10細(xì)胞24h后進(jìn)行核Hoechst染色發(fā)現(xiàn),25μM處理組部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)核體積縮小,熒光染色增強(qiáng),少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃染和凋亡小體;100μM處理組出現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡(核固縮,核碎裂,可見(jiàn)明顯的凋亡小體);200μM處理組出現(xiàn)30%以上的細(xì)胞死亡漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液,未做進(jìn)一步的核Hoechst染色。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用100μMTG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

11、r>   ⑵分別用50μM,100μM,200μM,400μM H2O2處理A10細(xì)胞24h后進(jìn)行核Hoechst染色發(fā)現(xiàn),100μM處理組開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,200μM處理組出現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡,400μM處理組出現(xiàn)15%以上的細(xì)胞死亡漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液,未做進(jìn)一步的核Hoechst染色。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用200μM H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
   小結(jié):①ClC-3可以保護(hù)TG和H2O2誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡。②Y284F突變可以顯著減

12、弱ClC-3對(duì)TG誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,而Y284D突變可以增強(qiáng)ClC-3對(duì)TG誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。③Y284F突變可以顯著減弱ClC-3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,而Y284D突變可以增強(qiáng)ClC-3對(duì)H2O2誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
   第三章:ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化的激活機(jī)制。
   研究ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化的Src激酶依賴的激活機(jī)制,運(yùn)用Src激酶選擇性抑

13、制劑和基因轉(zhuǎn)染技術(shù),研究Src激酶對(duì)ClC-3通道介導(dǎo)的氯電流和氯運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用,并運(yùn)用免疫共沉淀的方法探討Src激酶與ClC-3蛋白的相互作用。結(jié)果如下:
   ⑴在大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞及A10胚胎鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株上都可檢測(cè)到Src蛋白的表達(dá)。
   ⑵在±80mV,低滲刺激后細(xì)胞的電流密度分別從等滲條件下的-9.0±2.4pA·pF-1和15.6±3.2pA·pF-1增加至-22.2±6.0

14、pA·pF-1和46.5±10.0 pA·pF-1(n=16,P<0.01)。
   ⑶在±80mV,低滲刺激后細(xì)胞的電流密度分別從等滲條件下的-16.5±4.2pA·pF-1和34.9±8.5 pA·pF-1增加至-53.1±15.7 pA·pF-1和102.6±19.4 pA·pF-1(n=13,P<0.05)。
   ⑷SrcA(活性形式Src激酶)和SrcI(非活性形式Src激酶)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A10細(xì)胞,進(jìn)行全細(xì)

15、胞電流記錄。未轉(zhuǎn)染的A10細(xì)胞組在等滲時(shí)的基礎(chǔ)電流在±80mV時(shí)分別為-6.5±2.3 pA·pF-1和14.2±3.1 pA·pF-1(n=16),轉(zhuǎn)染空載體的A10細(xì)胞組在等滲時(shí)的基礎(chǔ)電流在±80mV時(shí)分別為-6.9±2.5 pA·pF-1和14.8±4.6pA·pF-1(n=6),與未轉(zhuǎn)染的A10細(xì)胞組相比沒(méi)有明顯區(qū)別。
   ⑸A10細(xì)胞在等滲時(shí)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度為30.49±1.01mM(n=30),在低滲刺激下A10細(xì)

16、胞內(nèi)氯離子濃度下降到24.17±1.03mM,氯離子濃度下降值為6.32±0.44 mM,下降率為20.72±2.53%(n=30)。
   小結(jié):①血管平滑肌細(xì)胞存在Src蛋白表達(dá)。②Src蛋白酪氨酸激酶選擇性抑制劑SU6656可以濃度依賴性地抑制A10細(xì)胞和過(guò)表達(dá)ClC-3蛋白的A10細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)性的氯電流。③活性形式的Src蛋白酪氨酸激酶增強(qiáng)A10細(xì)胞容積調(diào)節(jié)性的氯電流;非活性形式的Src蛋白酪氨酸激酶抑制A10細(xì)胞容積

17、調(diào)節(jié)性的氯電流。④過(guò)表達(dá)活性的Src蛋白酪氨酸激酶增強(qiáng)A10細(xì)胞容積調(diào)節(jié)性氯運(yùn)動(dòng),過(guò)表達(dá)非活性的Src蛋白酪氨酸激酶抑制A10細(xì)胞容積調(diào)節(jié)性氯運(yùn)動(dòng)。⑤Src激酶與ClC-3氯通道存在蛋白質(zhì)的相互作用。⑥我們結(jié)果提示Y284,Y572是Src激酶調(diào)控ClC-3氯通道的關(guān)鍵功能位點(diǎn)。
   結(jié)論:
   ⑴Y284,Y572是ClC-3氯通道關(guān)鍵的酪氨酸磷酸化功能位點(diǎn),Y284,Y572位點(diǎn)的磷酸化可以增強(qiáng)ClC-3氯通道活

18、性,以Y284位點(diǎn)的作用尤為顯著。
   ⑵ClC-3可以保護(hù)TG和H2O2誘導(dǎo)的A10血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。Y284F突變可以顯著減弱ClC-3對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,Y284D突變可以顯著增強(qiáng)ClC-3對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,提示功能位點(diǎn)相關(guān)的酪氨酸磷酸化信號(hào)對(duì)ClC-3參與的細(xì)胞凋亡等多種生理過(guò)程有重要影響。
   ⑶Src激酶直接參與了ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點(diǎn)(Y284,Y572)相關(guān)的通道激活機(jī)制,Sr

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