玉米ZmSTKR基因的表達及其蛋白的磷酸化分析.pdf

1、蛋白質(zhì)磷酸化是一種廣泛的翻譯后修飾，是指在蛋白質(zhì)激酶催化下將ATP或GTP的γ位磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的過程。蛋白質(zhì)磷酸化參與許多生物學過程，如信號轉(zhuǎn)導、細胞分裂、生長發(fā)育和脅迫響應等。本課題組前期研究分離得到了一個控制玉米行粒數(shù)QTL的候選基因，該基因編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體(serine/threonine protein kinase receptor: ZmSTKR)。本實驗采用半定量RT-PCR和實時

2、熒光定量PCR方法，分析ZmSTKR在兩個近等基因系材料Ye478和SL57-6間不同發(fā)育時期、不同組織間的表達量差異;采用35S-CaMV啟動子驅(qū)動ZmSTKR-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞，進行ZmSTKR的亞細胞定位;利用大腸桿菌原核表達體系，表達并分離純化ZmSTKR蛋白;采用體外磷酸化分析，研究ZmSTKR自磷酸化及其對互作蛋白Liguleless2(LG2)的磷酸化，以期探明ZmSTKR的調(diào)控途徑。主要研究結(jié)果如下:
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3、.基因時空表達分析表明，ZmSTKR在Ye478和SL57-6兩份近等基因系材料的根、莖、葉、雌穗、雄穗各個組織中都有表達，即ZmSTKR為組成型表達基因，但是在不同的組織中表達量不同。將雌穗細分為SPM(spikelet-pair meristems)、SM(spikelet meristems)和FM(Floral meristem)三個不同發(fā)育時期，qRT-PCR結(jié)果顯示，在SPM和SM分化時期，ZmSTKR在SL57-6中的表達

4、量顯著高于Ye478，并且呈遞減趨勢;另外，在Ye478的花序分化的三個時期，該基因的表達量沒有明顯差異。這些結(jié)果說明，ZmSTKR的表達在Ye478和SL57間存在差異，且具有組織和發(fā)育時期的特異性。因此，Ye478和SL57-6間行粒數(shù)的差異可能與ZmSTKR在花序中表達差異相關(guān)。
　　2.洋蔥表皮進行ZmSTKR亞細胞定位，結(jié)果顯示，ZmSTKR-GFP融合蛋白定位在細胞核和細胞質(zhì)中，說明ZmSTKR可能會在細胞質(zhì)和細胞核中

5、起作用。
　　3.定點突變分別獲得了ZmSTKR的ATP結(jié)合位點突變體(ZmSTKR-74R)、活化位點突變體(ZmSTKR-172E)、這兩個位點的雙突變體（ZmSTKR-double），原核表達并純化得到了這些突變體的蛋白GST/ZmSTKR-74R、GST/ ZmSTKR-172E和GST/ZmSTKR-double。體外磷酸化分析表明，ZmSTKR不能發(fā)生自身磷酸化，ZmSTKR-172E也不能發(fā)生自身磷酸化，但是ZmST

6、KR-74R和ZmSTKR-double能夠發(fā)生自身磷酸化，說明該蛋白質(zhì)的第74位ATP結(jié)合位點對其自身磷酸化的重要性。由于本研究所表達的蛋白是基于ZmSTKR位點Ye478的等位基因序列，而其近等基因系SL57-6的ZmSTKR蛋白在ATP結(jié)合位點與Ye478的ZmSTKR具有1個氨基酸的差異。我們推測該氨基酸的差異可能導致ZmSTKR蛋白功能的差異，進而導致行粒數(shù)的差異。另外，ZmSTKR對其互作蛋白LG2的磷酸化分析表明，ZmST