PK2對(duì)大鼠睪丸免疫細(xì)胞亞群及誘生型一氧化氮合酶表達(dá)影響的初步研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述。
　　第一部分 PK2對(duì)大鼠睪丸免疫細(xì)胞亞群和iNOS的影響
　　目的：研究PK2對(duì)睪丸免疫細(xì)胞亞群和iNOS的影響，初步探討PK2對(duì)睪丸免疫微環(huán)境的影響。
　　方法：將PK2蛋白（分為50pmol、100pmol、300pmol）通過(guò)睪丸網(wǎng)注射到成年SD大鼠睪丸，對(duì)照組給予生理鹽水，每組12只，一周后取睪丸做HE染色。各組睪丸經(jīng)膠原酶Ⅰ消化，淋巴細(xì)胞分離液分離后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PK2注射組

2、睪丸間質(zhì)免疫細(xì)胞亞群的變化。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)升高組iNOS表達(dá)情況。
　　結(jié)果：隨著PK2蛋白劑量的增加，睪丸形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)不同程度的改變，間質(zhì)內(nèi)血管和細(xì)胞增多，生精上皮萎縮，脫落，尤其以300pmol表現(xiàn)最明顯。流式細(xì)胞術(shù)顯示隨著劑量的增加，睪丸間質(zhì)內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量增多，尤其以CD8+淋巴細(xì)胞、ED1+ED2-、ED1-ED2+、ED1+ED2+巨噬細(xì)胞數(shù)量增加明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。iNOS表達(dá)水平升高

3、,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：PK2影響睪丸間質(zhì)內(nèi)的免疫細(xì)胞數(shù)量及亞群，增加iNOS表達(dá)水平，影響睪丸免疫平衡。
　　第二部分 PK2siRNA睪丸內(nèi)干擾效果
　　目的：PK2表達(dá)質(zhì)粒與化學(xué)合成的PK2干擾序列共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，篩選出PK2的有效干擾序列，觀察其在乳鼠睪丸內(nèi)的干擾效果。
　　方法：針對(duì)大鼠PK2mRNA序列設(shè)計(jì)三條不同的干擾序列（siPK2-S1，S2，S3），

4、通過(guò)將Cy3熒光標(biāo)記的對(duì)照siRNA稀釋成20nM、30nM、50 nM和100nM四個(gè)濃度梯度，確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。在陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipfectamine2000介導(dǎo)下，將PK2表達(dá)質(zhì)粒與三段siRNA序列共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)要求分為陽(yáng)性對(duì)照組（加PK2表達(dá)質(zhì)粒，P）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性siRNA序列，N）、實(shí)驗(yàn)組（S1，S2，S3）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)然后48h各組細(xì)胞PK2mRNA表達(dá)情況。采用Clontech

5、試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染72h后 PK2蛋白表達(dá)情況，確定最有效的干擾序列。最有效干擾序列經(jīng)FAM修飾后通過(guò)睪丸網(wǎng)注射到生后12天的雄性SD乳鼠睪丸，對(duì)照組注射陰性對(duì)照序列，每組6只。一周后取睪丸做HE染色。RT-PCR檢測(cè)PK2mRNA在睪丸中的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)檢測(cè)PK2蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：Cy3-siRNA20nM組可見(jiàn)微弱的紅色熒光，隨著Cy3-siRNA濃度的增加熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，50nM大多數(shù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，選定50nM