MicroRNA 126-5p調(diào)控骨巨細(xì)胞瘤增殖及破骨微環(huán)境的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:骨巨細(xì)胞瘤(GCT)是臨床上較為常見的原發(fā)良性骨腫瘤，約占全部骨腫瘤的6％。骨巨細(xì)胞瘤常見于20-40歲人群，好發(fā)于四肢長骨的干骺端。盡管被定義為良性腫瘤，骨巨細(xì)胞瘤往往表現(xiàn)出極強(qiáng)的侵襲能力，而溶骨性骨破壞是其最為顯著的臨床特征。溶骨性骨破壞可引起嚴(yán)重骨痛并可導(dǎo)致病理性骨折，是影響骨巨細(xì)胞瘤患者生活質(zhì)量的主要因素。骨巨細(xì)胞瘤對放化療均不敏感，外科手術(shù)切除病灶是其最主要的治療方案。外科切除技術(shù)的進(jìn)展，特別是整塊切除方式在臨

2、床上的廣泛應(yīng)用使得骨巨細(xì)胞瘤的治療上了一個臺階，但骨巨細(xì)胞瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)率仍居高不下，最高可達(dá)41.7％。鑒于其侵襲性生長方式和術(shù)后高復(fù)發(fā)率，目前傾向于將骨巨細(xì)胞瘤定義為交界性或具有惡性潛能的骨腫瘤。溶骨性骨破壞和腫瘤異常增殖是骨巨細(xì)胞瘤治療中的難點(diǎn)，也是影響患者生活質(zhì)量和整體生存時間的關(guān)鍵影響因素，但其具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。
　　骨巨細(xì)胞瘤起源于骨髓內(nèi)間葉組織，主要由三種細(xì)胞所構(gòu)成，分別是:破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞、梭形基質(zhì)細(xì)胞以及

3、單核細(xì)胞。既往研究曾認(rèn)為多核巨細(xì)胞是骨巨細(xì)胞瘤的主要效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤成分，但近幾年來的研究證實(shí)梭形基質(zhì)細(xì)胞(GCTSC)才是骨巨細(xì)胞瘤中唯一具有無限增殖能力的腫瘤成分并且在骨巨細(xì)胞瘤溶骨性骨破壞過程中起到最關(guān)鍵的作用。GCTSC來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，而不同于BMSC的是，GCTSC不但借由自身的異常細(xì)胞復(fù)制能力維持骨巨細(xì)胞瘤的過度增殖特性，還可以分泌大量破骨微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞因子來誘導(dǎo)多核巨細(xì)胞的形成導(dǎo)致溶骨性骨破壞。因此，探索

4、GCTSC如何具備異常增殖以及過度分泌破骨相關(guān)因子的能力，對揭示骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)生以及溶骨性骨破壞的分子機(jī)制至關(guān)重要，對骨巨細(xì)胞瘤的預(yù)防、治療以及尋找新的藥物靶點(diǎn)具有較高的基礎(chǔ)科學(xué)及實(shí)際應(yīng)用價值。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）是體內(nèi)重要的膠原酶，可高效降解軟骨中的蛋白多糖，同時還具有降解細(xì)胞表面的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原的能力。MMP-13在血管再生、創(chuàng)傷修復(fù)、結(jié)締組織病、腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移等多個生理病理過程中發(fā)揮重要作用，研究證實(shí)M

5、MP-13在骨巨細(xì)胞瘤中表達(dá)量升高并且參與骨巨細(xì)胞瘤破骨微環(huán)境以及溶骨灶的形成。
　　甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)是由甲狀旁腺細(xì)胞分泌的單鏈多肽類激素，與甲狀旁腺素有著同樣的N端結(jié)構(gòu)，通過與甲狀旁腺素Ⅰ型受體結(jié)合在體內(nèi)發(fā)揮作用。既往研究發(fā)現(xiàn)PTHrP在骨巨細(xì)胞瘤中表達(dá)量升高，并通過調(diào)控RANKL(NF-κ B ligand)、MMP-13、IL-8等破骨相關(guān)因子的表達(dá)促進(jìn)溶骨灶的形成，同時PTHrP還通過抑制梭形基質(zhì)細(xì)胞的凋亡增

6、強(qiáng)骨巨細(xì)胞瘤增殖能力。
　　Runt轉(zhuǎn)錄因子-2(Runx2)是Runt家族重要成員，在成骨細(xì)胞分化及骨骼形成過程中發(fā)揮重要作用。研究表明Runx2在骨巨細(xì)胞瘤中表達(dá)量明顯升高并通過調(diào)控多個因子的表達(dá)影響骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)生以及生物學(xué)行為。
　　微小RNA(microRNA)是一類平均長度約為22 nt的非編碼RNA，在體內(nèi)廣泛存在，主要通過與下游靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域結(jié)合并抑制其翻譯過程而發(fā)揮作用。通過對人類基因組序列

7、的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)超過三分之一的人類基因可被microRNA所調(diào)控。目前microRNA在腫瘤中的作用是國內(nèi)外基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，但其在骨巨細(xì)胞瘤中的具體作用機(jī)制尚不明確。MicroRNA126-5p（miR-126-5p）定位于表皮生長因子樣蛋白基因內(nèi)含子區(qū)域，研究證實(shí)miR-126-5p在肺癌、乳腺癌、腎癌的發(fā)生及惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用，但它在骨巨細(xì)胞瘤中的作用尚未有報(bào)道。
　　研究內(nèi)容與方法:選取2011年07月

8、至2012年06月在第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院接受手術(shù)治療的骨巨細(xì)胞瘤患者的典型腫瘤標(biāo)本，另取正常松質(zhì)骨對照組織進(jìn)行microRNA基因芯片檢查尋找在骨巨細(xì)胞瘤中表達(dá)量具有明顯差異的microRNA。利用生物信息學(xué)分析查找可能在骨巨細(xì)胞瘤中發(fā)揮重要作用的miRNA及其潛在靶基因。
　　利用qRT-PCR、分子原位雜交、熒光免疫觀測技術(shù)檢測miR-126-5p在骨巨細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)情況，利用PCR、qRT-PCR、Western b

9、lot、ELISA驗(yàn)證MMP-13、PTHrP、Runx2在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況。選取骨巨細(xì)胞瘤典型腫瘤標(biāo)本進(jìn)行HE及免疫組化染色進(jìn)一步明確miR-126-5p、MMP-13、PTHrP、Runx2在骨巨細(xì)胞瘤中具體表達(dá)情況。通過構(gòu)建熒光素酶活性報(bào)告系統(tǒng)以及潛在結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變操作明確miR-126-5p對MMP-13、PTHrP、Runx2的調(diào)控關(guān)系，并向GCTSC細(xì)胞以及骨肉瘤MG63細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-126-5p mimic和mi

10、R-126-5p antagonist進(jìn)一步明確miR-126-5p對三個靶基因的調(diào)控方式。
　　利用Talen技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)miR-126-5p的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)定株OE-miR-126 GCTSC并對其進(jìn)行驗(yàn)證。同時利用qRT-PCR、Western blot、ELISA檢測OE-miR-126 GCTSC中miR-126-5p、MMP-13、PTHrP、Runx2的表達(dá)情況。將OE-miR-126 GCTSC與骨髓單核細(xì)

11、胞條件共培養(yǎng)檢測破骨細(xì)胞分化和多核巨細(xì)胞的數(shù)目以明確miR-126-5p對破骨細(xì)胞分化的影響;利用骨片實(shí)驗(yàn)檢測miR-126-5p對GCTSC介導(dǎo)的溶骨性骨破壞的影響;利用細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞儀、CCK8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測觀察miR-126-5p對GCTSC增殖能力的影響。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-126-5p在體內(nèi)對于破骨微環(huán)境及GCTSC增殖活性的影響，構(gòu)建了一系列動物模型進(jìn)行驗(yàn)證。首先構(gòu)建了去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型(OVX小鼠模

12、型)檢測miR-126-5p對破骨微環(huán)境的影響;接著利用雞胚尿膜囊模型檢測miR-126-5p對GCTSC增殖能力以及骨巨細(xì)胞瘤成瘤的影響;最后我們構(gòu)建了miR-126-5p特異性敲除鼠全面觀察miR-126-5p對于小鼠生長發(fā)育過程的影響。
　　研究結(jié)果與結(jié)論:在此項(xiàng)研究中得到了以下結(jié)果:
　　1、MicroRNA芯片提示miR-126-5p在骨巨細(xì)胞瘤中表達(dá)降低，而對腫瘤組織樣本qRT-PCR以及分子原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mi

13、R-126-5p在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)量較正常松質(zhì)骨組織中明顯降低，差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　2、生物信息學(xué)分析提示miR-126-5p可能在骨巨細(xì)胞瘤中發(fā)揮重要作用，而MMP-13、PTHrP和Runx2是其潛在的靶基因;
　　3、qRT-PCR、Western blot和ELISA檢測提示MMP-13、PTHrP、Runx2、RANKL、IL-8在骨巨細(xì)胞瘤標(biāo)本中表達(dá)量升高;HE及免疫組化染色發(fā)現(xiàn)上述因子是由骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)

14、細(xì)胞所分泌的;
　　4、熒光素酶活性檢測實(shí)驗(yàn)提示miR-126-5p可直接結(jié)合MMP-13、PTHrP和Runx2mRNA3'UTR區(qū)域并抑制其表達(dá)，而進(jìn)一步的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)則證實(shí)miR-126-5p主要影響MMP-13、PTHrP、Runx2的蛋白水平表達(dá);
　　5、利用Talen技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)miR-126-5p的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)定株 OE-miR-126 GCTSC，該細(xì)胞株中miR-126-5p的表達(dá)量提升了20倍;<

15、br>　　6、破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，OE-miR-126 GCTSC實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞分化受到抑制，破骨細(xì)胞數(shù)目較對照組明顯減少，破骨活性明顯降低;
　　7、骨片實(shí)驗(yàn)中，OE-miR-126 GCTSC實(shí)驗(yàn)組骨片骨破壞灶較對照組明顯減小;
　　8、增殖實(shí)驗(yàn)中，OE-miR-126 GCTSC實(shí)驗(yàn)組基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞增殖活性受到抑制;
　　9、OVX小鼠實(shí)驗(yàn)中，摘除卵巢后小鼠體內(nèi)miR-126-5p表達(dá)量明顯降低，而M

16、MP-13、PTHrP、Runx2的表達(dá)量明顯升高，給予外源性miR-126-5p可有效抑制OVX小鼠骨量減少進(jìn)程，而抑制體內(nèi)miR-126-5p表達(dá)則加重小鼠體內(nèi)骨質(zhì)破壞;
　　10、雞胚尿膜囊實(shí)驗(yàn)中，OE-miR-126 GCTSC實(shí)驗(yàn)組骨巨細(xì)胞瘤瘤體較對照組明顯減小，而多核巨細(xì)胞數(shù)目明顯降低;
　　11、利用TALEN技術(shù)成功構(gòu)建了12只F1代miR-126-5p特異性敲除鼠，需進(jìn)一步培養(yǎng)繁殖純合子miR-126-5p

17、敲除鼠并全面觀察miR-126-5p對小鼠成長發(fā)育過程的影響。
　　通過上述研究結(jié)果，我們證實(shí)miR-126-5p作為一個抑癌基因在骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)生以及生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，它通過直接調(diào)控MMP-13、PTHrP、Runx2的表達(dá)影響GCTSC的增殖以及破骨微環(huán)境的形成。同時也發(fā)現(xiàn)miR-126-5p還可以間接調(diào)控RANKL、IL-8等多個因子的表達(dá)，而MMP-13、PTHrP以及Runx2之間也存在較為復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，因此m