與弓形蟲微線體蛋白互作的宿主蛋白的篩選和鑒定.pdf

1、剛地弓形蟲是頂復(fù)門寄生蟲中的一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲，是非常重要的人畜共患病原。弓形蟲生活史復(fù)雜，包括人類在內(nèi)的幾乎所有溫血動物均可以作為中間宿主而感染。弓形蟲如此廣泛的宿主范圍與其成功的宿主細胞入侵和調(diào)節(jié)機制密切相關(guān)。在弓形蟲入侵和調(diào)節(jié)宿主細胞的過程中，蟲體微線體分泌的微線體蛋白可以黏附宿主細胞并對宿主細胞起到重要的調(diào)節(jié)作用。盡管多數(shù)微線體蛋白均含有不同的黏附結(jié)構(gòu)域，但與微線體蛋白互作的宿主蛋白仍知之甚少，所以鑒定與微線體蛋白特異互作的

2、宿主蛋白可以為進一步闡釋弓形蟲入侵和調(diào)節(jié)宿主的機制提供理論依據(jù)，同時為宿主蛋白在病原感染時的作用研究奠定基礎(chǔ)。
　　為此，本研究從病原與宿主相互作用的角度出發(fā)，以弓形蟲微線體蛋白AMA1、MIC2和MIC3為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選鼠cDNA文庫，得到了2個與MIC2整合素A樣結(jié)構(gòu)域相互作用的宿主蛋白，8個與MIC3相互作用的宿主蛋白。在此基礎(chǔ)上，利用不同的蛋白質(zhì)互作方法驗證了微線體蛋白MIC3與宿主蛋白Spata3和Dkk2

3、在體內(nèi)、體外的相互作用。之后，對宿主篩選蛋白Dkk2所在的Wnt信號通路進行研究，探索弓形蟲對宿主細胞該通路的影響。
　　(1)與弓形蟲微線體蛋白相互作用宿主蛋白的篩選利用特異引物從弓形蟲RH株速殖子cDNA中擴增微線體蛋白AMA1的胞外域，MIC2的胞外域和MIC3全長編碼序列。利用擴增獲得的微線體蛋白序列構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，并檢測誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達，自激活和毒性。由于MIC2胞外域誘餌質(zhì)粒對酵母雙雜交系統(tǒng)存在自激活，因

4、此將其截短成兩個結(jié)構(gòu)域——整合素A樣結(jié)構(gòu)域(A/I)和血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(TSR)，并構(gòu)建誘餌質(zhì)粒。通過自激活檢測發(fā)現(xiàn)，TSR結(jié)構(gòu)域是導(dǎo)致MIC2出現(xiàn)自激活的重要結(jié)構(gòu)域，因此用A/I結(jié)構(gòu)域進行宿主蛋白篩選。通過酵母接合的方式對鼠cDNA文庫進行篩選，得到2個可以與MIC2-A/I相互作用的宿主蛋白，分別為鼠LAMTOR1和RNaseH2b;得到8個可以與MIC3相互作用的宿主蛋白，分別為鼠的Svil，Phf7，Dkk2，Tme

5、m100，Spata3 iso2，Spata3 iso3和兩個非典型蛋白LOC72128，LOC210940;未篩選到與AMA1相互作用的宿主蛋白。
　　(2)MIC3陽性互作的驗證利用MIC3篩選的宿主蛋白編碼序列設(shè)計引物，從鼠cDNA中成功擴增得到Phf7，Dkk2，Tmem100和Spata3 iso3全長編碼序列，從文庫質(zhì)粒中擴增得到Svil和兩個非典型蛋白的文庫插入片段序列。分別構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，并與構(gòu)建在pGAD

6、T7的MIC3進行點對點驗證，發(fā)現(xiàn)MIC3與Dkk2，Spata3全長以及兩個非典型蛋白文庫插入片段存在相互作用。此外，將MIC3連入原核表達載體融合表達GST-MIC3蛋白，將宿主蛋白Spata3、Dkk2連入另一種原核表達載體融合表達His-Spata3和His-Dkk2蛋白。分別純化蛋白并用GST-Pull down驗證了MIC3與宿主蛋白Spata3，Dkk2在體外存在相互作用。將MIC3和宿主蛋白Spata3，Dkk2分別連接

7、入不同的真核表達載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用免疫共沉淀和雙分子熒光互補驗證了MIC3與宿主蛋白Spata3，Dkk2在哺乳動物細胞內(nèi)存在相互作用。
　　(3)MIC3與宿主蛋白互作結(jié)構(gòu)域的確定根據(jù)文獻報道和生物信息學(xué)分析將全長MIC3分為兩個結(jié)構(gòu)域——幾丁質(zhì)結(jié)合樣結(jié)構(gòu)域(CBL)和表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF)。分別將這兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)建至pGADT7載體，利用酵母雙雜交點對點與MIC3篩選的宿主蛋白誘餌質(zhì)粒進行相互作用鑒定。結(jié)果顯示，CB

8、L結(jié)構(gòu)域不能與任何篩選宿主蛋白相互作用;與全長MIC3相同，EGF結(jié)構(gòu)域可以同宿主蛋白Spata3，Dkk2和兩個非典型蛋白進行相互作用，說明EGF結(jié)構(gòu)域是MIC3與宿主蛋白相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。
　　(4)弓形蟲對宿主Wnt/β-catenin信號通路的影響由于MIC3篩選的宿主蛋白Dkk2具有調(diào)節(jié)宿主Wnt/β-catenin信號通路的功能，因此我們研究弓形蟲對宿主該信號通路的影響。利用TOP-Flash螢火蟲熒光素酶報告基因

9、系統(tǒng)進行檢測，發(fā)現(xiàn)弓形蟲不同感染豐度都不能對宿主Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生明顯的影響;同時構(gòu)建MIC3真核表達質(zhì)粒，利用MIC3真核表達蛋白刺激宿主細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)MIC3蛋白對宿主該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也無明顯影響;通過Western blot對弓形蟲速殖子感染或MIC3蛋白表達的宿主細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)弓形蟲速殖子和MIC3蛋白不能使Wnt信號通路關(guān)鍵元件β-catenin的表達量出現(xiàn)明顯變化。以上結(jié)果表明，弓形蟲速殖子和MIC3蛋白不能對宿主Wnt/