乙型腦炎病毒NS1蛋白的宿主互作蛋白篩選與鑒定.pdf

1、乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis viruses.JEV）是黃病毒科黃病毒屬的一員，其引起的乙型腦炎是一種蚊媒性的人畜共患病，具有明顯的季節(jié)性和傳染性。人感染JEV主要造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，豬感染主要引起母豬流產(chǎn)、公豬睪丸炎和仔豬腦炎等癥狀。NS1蛋白是JEV的一個非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復(fù)制、感染等過程。本研究以豬源JEV的NS1蛋白為誘餌蛋白，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)從人腦組織cDNA文庫中篩選、鑒定

2、與其發(fā)生相互作用的宿主細胞互作蛋白，本研究將對闡明NS1蛋白在JEV的增殖復(fù)制機制中的作用奠定一定的基礎(chǔ)。
　　1、乙型腦炎病毒NS1蛋白誘餌酵母菌的構(gòu)建
　　提取豬源JEV SCYA201201株的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，PCR擴增NS1基因，克隆至pGBKT7載體，經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定和序列測定，成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NS1，JEV NS1基因大小為1245bp;將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NS1轉(zhuǎn)化至酵

3、母菌Y2HGold感受態(tài)細胞，構(gòu)建了JEV NS1蛋白誘餌酵母菌。
　　運用Western blot技術(shù)從JEV NS1蛋白誘餌酵母菌的總蛋白樣品檢測到大小約46kDa的NS1蛋白，表明NS1基因能在誘餌酵母菌中表達。對該誘餌酵母菌進行毒性效應(yīng)和自激活效應(yīng)檢測:誘餌酵母菌與空載對照酵母菌在SD/-Trp平板上的長勢和菌落數(shù)無明顯差異，表明NS1片段的插入對誘餌酵母菌無毒性作用;誘餌酵母菌與對照酵母菌在SD/-Trp/X-α-Gal

4、平板上長出乳白色菌落且沒有變成藍色，在SD/-Trp/X-a-Gal/AbA平板上未見菌落，證明誘餌酵母菌無自激活效應(yīng)。本研究成功構(gòu)建了JEV NS1蛋白誘餌酵母菌，為進一步篩選JEV NS1蛋白相互作用的宿主蛋白提供了研究材料。
　　2、乙型腦炎病毒NS1蛋白的宿主互作蛋白篩選
　　運用酵母雙雜交技術(shù)將JEV NS1蛋白誘餌酵母菌與人腦組織cDNA文庫菌進行雜交和兩輪篩選，第一輪以SD/-Trp/-Leu/X-a-Gal/

5、AbA營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基平板對雜交產(chǎn)物進行篩選，獲得72個克隆子。第二輪篩選挑取藍色菌落克隆子，分別接種于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基平板，并反復(fù)進行2次，共獲得7個陽性克隆子。進一步對陽性克隆子利用Ampicillin抗性篩選、PCR鑒定和序列測定，獲得5個陽性單克隆子;測定序列在Genbank上進行BLAST比對，5個陽性克隆分別對應(yīng)α2-巨球蛋白(α2M)、人神經(jīng)元性分化因子6(N

6、euroD6)、DAZassociated protein2(DAZAP2)、金屬蛋白酶抑制劑4（TIMP-4）和鋅指蛋白251(ZNF251)。
　　對獲得的5個陽性克隆子進行回復(fù)雜交驗證實驗，分別將5個陽性克隆子的文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Y187酵母感受態(tài)細胞構(gòu)建獵物酵母菌，將獵物酵母菌與誘餌酵母菌一對一組合進行回復(fù)雜交驗證，5個獵物酵母菌均為陽性結(jié)果。本研究應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)從人腦組織cDNA文庫中成功篩選到了5種與JEV NS1蛋白

7、相互作用的宿主蛋白。
　　3、乙型腦炎病毒NS1蛋白與宿主互作蛋白相互作用的鑒定
　　構(gòu)建NS1蛋白和各宿主蛋白真核表達質(zhì)粒，提取豬源乙腦SCYA201201株的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模版，PCR擴增NS1基因序列克隆至pEGFP載體，經(jīng)PCR鑒定、雙酶切和測序分析，成功構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒pEGFP-NS1，插入片段大小為1245bp;提取人胚腎細胞（293細胞）的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，根據(jù)Gene Ba

8、nk上5個宿主蛋白的編碼區(qū)序列設(shè)計合成引物并應(yīng)用PCR擴增相應(yīng)的基因序列，克隆至pCMV-HA載體，經(jīng)PCR鑒定、雙酶切和測序分析，成功構(gòu)建各互作蛋白真核表達質(zhì)粒，插入片段大小分別為α2M741bp、NEUROD61012bp、DAZAP2504bp、 TIMP-4672bp、ZNF251825bp。
　　運用Western blot檢測構(gòu)建好的真核表達質(zhì)粒在293細胞中的表達，結(jié)果顯示JEV NS1蛋白與3個宿主蛋白（α2M、D