基于蛋白質組學篩選弓形蟲病候選診斷抗原.pdf

1、目的：弓形蟲病是世界范圍的嚴重機會致病性寄生蟲病,也是一種重要的人獸共患原蟲病。全球人口大約有30％是攜帶者,在歐洲是最常見的寄生蟲病。由于目前尚沒有國產(chǎn)的批準上市弓形蟲抗體檢測試劑盒,檢查和處理尚未規(guī)范,常見假陽性反應,導致不同實驗室間的結果缺乏可比性,臨床診斷和治療缺乏可靠的依據(jù)。本研究旨在利用血清蛋白質組學技術篩選弓形蟲病診斷候選分子,并進一步評估其在弓形蟲病診斷中的作用。
　　方法：弓形蟲RH株速殖子可溶性蛋白經(jīng)過二維電泳

2、(2-DE)后,用不同期弓形蟲感染患者血清進行Western-blot分析,將Western-blot結果與同源的經(jīng)考馬斯亮藍染色的2-DE凝膠比對,切取匹配的點用胰酶消化后進行質譜測序,分析質譜測序結果,從中挑選潛在可能的生物標志物進一步克隆重組及原核表達。將純化后的原核表達產(chǎn)物包被于聚苯乙烯微量反應板,用ELISA方法評估其在弓形蟲病診斷中的價值;同時將BALB/c小鼠口服弓形蟲PRU株包囊,分階段定期收集小鼠血清,用ELISA方法

3、檢測血清中的特異性IgG及IgM抗體的動態(tài)變化情況。
　　結果：利用血清蛋白質組學方法從弓形蟲RH株速殖子中篩選出50多個具有免疫反應性的蛋白點,其中慢性感染IgG陽性組膠片上有21個陽性點能夠與同源的2-DE凝膠明確匹配,質譜測序結果顯示,這21個點對應13種不同的蛋白質;急性感染IgM陽性組膠片上有3個陽性點能夠與同源的2-DE凝膠明確匹配,質譜測序只檢測出其中1種蛋白:棒狀蛋白2(ROP2)。進一步成功表達出了重組蛋白ROP

4、2186-533(第186到533的氨基酸序列),純化后的rROP2186-533蛋白濃度高達6mg/ml;診斷評估中的ELISA結果顯示,rROP2186-533對弓形蟲特異的IgM和IgG抗體的敏感性分別為100%和0%,并且IgM抗體診斷特異性達到了100%,與正常對照組相比具有顯著性差異(P＜0.001)。
　　BALB/c小鼠口服PRU包囊,用rROP2186-533蛋白包被微孔板的ELISA結果顯示:感染2天后小鼠血清

5、中的特異性IgM抗體迅速升高,至14天達到峰值后迅速降低,28天時特異性IgM抗體消失,其滴度與感染前相同。此IgM抗體分布趨勢與其他學者研究結果一致;而IgG抗體在感染全程中均為陰性。
　　結論：利用血清蛋白質組學技術成功地從弓形蟲RH株速殖子中篩選出了ROP2,并成功克隆和重組了rROP2186-533;研究結果證明,rROP2186-533是特異性診斷IgM抗體的弓形蟲感染診斷候選分子,能明確的鑒別急性期感染。同時也證明,血