基于蛋白質(zhì)組學(xué)篩選弓形蟲病候選診斷抗原.pdf

1、目的：弓形蟲病是世界范圍的嚴(yán)重機(jī)會(huì)致病性寄生蟲病,也是一種重要的人獸共患原蟲病。全球人口大約有30％是攜帶者,在歐洲是最常見的寄生蟲病。由于目前尚沒有國產(chǎn)的批準(zhǔn)上市弓形蟲抗體檢測(cè)試劑盒,檢查和處理尚未規(guī)范,常見假陽性反應(yīng),導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果缺乏可比性,臨床診斷和治療缺乏可靠的依據(jù)。本研究旨在利用血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選弓形蟲病診斷候選分子,并進(jìn)一步評(píng)估其在弓形蟲病診斷中的作用。
　　方法：弓形蟲RH株速殖子可溶性蛋白經(jīng)過二維電泳

2、(2-DE)后,用不同期弓形蟲感染患者血清進(jìn)行Western-blot分析,將Western-blot結(jié)果與同源的經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的2-DE凝膠比對(duì),切取匹配的點(diǎn)用胰酶消化后進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)序,分析質(zhì)譜測(cè)序結(jié)果,從中挑選潛在可能的生物標(biāo)志物進(jìn)一步克隆重組及原核表達(dá)。將純化后的原核表達(dá)產(chǎn)物包被于聚苯乙烯微量反應(yīng)板,用ELISA方法評(píng)估其在弓形蟲病診斷中的價(jià)值;同時(shí)將BALB/c小鼠口服弓形蟲PRU株包囊,分階段定期收集小鼠血清,用ELISA方法

3、檢測(cè)血清中的特異性IgG及IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化情況。
　　結(jié)果：利用血清蛋白質(zhì)組學(xué)方法從弓形蟲RH株速殖子中篩選出50多個(gè)具有免疫反應(yīng)性的蛋白點(diǎn),其中慢性感染IgG陽性組膠片上有21個(gè)陽性點(diǎn)能夠與同源的2-DE凝膠明確匹配,質(zhì)譜測(cè)序結(jié)果顯示,這21個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)13種不同的蛋白質(zhì);急性感染IgM陽性組膠片上有3個(gè)陽性點(diǎn)能夠與同源的2-DE凝膠明確匹配,質(zhì)譜測(cè)序只檢測(cè)出其中1種蛋白:棒狀蛋白2(ROP2)。進(jìn)一步成功表達(dá)出了重組蛋白R(shí)OP

4、2186-533(第186到533的氨基酸序列),純化后的rROP2186-533蛋白濃度高達(dá)6mg/ml;診斷評(píng)估中的ELISA結(jié)果顯示,rROP2186-533對(duì)弓形蟲特異的IgM和IgG抗體的敏感性分別為100%和0%,并且IgM抗體診斷特異性達(dá)到了100%,與正常對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.001)。
　　BALB/c小鼠口服PRU包囊,用rROP2186-533蛋白包被微孔板的ELISA結(jié)果顯示:感染2天后小鼠血清

5、中的特異性IgM抗體迅速升高,至14天達(dá)到峰值后迅速降低,28天時(shí)特異性IgM抗體消失,其滴度與感染前相同。此IgM抗體分布趨勢(shì)與其他學(xué)者研究結(jié)果一致;而IgG抗體在感染全程中均為陰性。
　　結(jié)論：利用血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)成功地從弓形蟲RH株速殖子中篩選出了ROP2,并成功克隆和重組了rROP2186-533;研究結(jié)果證明,rROP2186-533是特異性診斷IgM抗體的弓形蟲感染診斷候選分子,能明確的鑒別急性期感染。同時(shí)也證明,血