弓形蟲蛋白酶的鑒定及免疫學研究.pdf

1、弓形蟲是一種屬于頂復門的專性細胞內(nèi)寄生原蟲，可引起弓形蟲病。弓形蟲病是廣泛分布于溫血動物包括人的一種人獸共患病，嚴重威脅著人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展，尤其對免疫功能受損的特殊人群，包括艾滋病患者、長期接受化學藥物治療的病人等往往有致命威脅。由于目前尚無針對弓形蟲感染的有效治療藥物，所以加強對弓形蟲病的預防工作顯得尤為重要。本研究利用生物信息學的方法分析預測了弓形蟲體內(nèi)4種蛋白酶的基本理化性質(zhì)、亞細胞定位、蛋白翻譯后修飾以及B細胞和T細胞抗原

2、表位;通過間接免疫熒光實驗在激光共聚焦顯微鏡下觀察了弓形蟲天冬氨酸蛋白酶TgASP1和TgASP3在蟲體內(nèi)外的表達情況;通過構(gòu)建相應的重組DNA疫苗來評價其免疫保護性。本研究填補了弓形蟲天冬氨酸蛋白酶TgASP3的研究空白，豐富了有關(guān)弓形蟲蛋白酶的基礎(chǔ)理論知識，為進一步推進研制出安全有效的弓形蟲疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的:鑒定天冬氨酸蛋白酶TgASP1和TgASP3在弓形蟲蟲體內(nèi)外的分布情況;構(gòu)建重組基因疫苗，評價弓形蟲半胱氨

3、酸蛋白酶TgCPB、TgCPL及天冬氨酸蛋白酶TgASP1和TgASP3的免疫保護性。
　　 方法:首先利用生物信息學方法來分析和預測弓形蟲體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶的基本理化性質(zhì)、亞細胞定位、蛋白翻譯后修飾、B細胞抗原表位和T細胞抗原表位;然后構(gòu)建重組原核表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21(DE3)制備可溶性的重組蛋白，純化后免疫小鼠獲得特異性抗體，通過間接免疫熒光實驗觀察蛋白酶TgASP1和TgASP3在蟲體內(nèi)外的表達情況

4、;最后通過構(gòu)建重組真核表達載體接種于BALB/c小鼠評價其免疫保護性。
　　 結(jié)果:利用生物信息學軟件分析了弓形蟲蛋白酶TgCPB、TgCPL、TgASP1和TgASP3的基本理化性質(zhì)、亞細胞定位、蛋白翻譯后的修飾等;利用多種方法預測了存在于弓形蟲蛋白酶TgCPB、TgCPL、TgASP1和TgASP3上的B細胞和T細胞抗原表位，篩選出了大量親水性好、可塑性強、可及性大和抗原指數(shù)高的潛在抗原表位區(qū)域，表明弓形蟲蛋白酶TgCPB、

5、TgCPL、TgASP1和TgASP3是良好的蛋白抗原;經(jīng)PCR體外擴增獲得了TgCPB、TgCPL、TgASP1和TgASP3的基因片段，大小分別為1710bp、1269bp、1863bp和1932bp;構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pET30a-TgCPB、pET30a-TgCPL、pET30a-TgASP1和pET30a-TgASP3及重組真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1-TgCPB、pBudCE4.1-TgCPL、pBudCE4.1-Tg

6、CPB-TgCPL、pEGFP-TgASP1和pEGFP-TgASP3，上述4種重組原核表達質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21(DE3)均獲得高效表達的重組蛋白，分離純化后通過免疫BALB/c小鼠獲得特異性較強的抗血清，進一步分離純化后獲得了抗上述蛋白酶的特異性抗體IgG。利用獲得的抗體IgG經(jīng)間接免疫熒光實驗在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察了蛋白酶TgASP1和TgASP3在弓形蟲體內(nèi)外的表達位置及相對表達量;上述5種重組真核表達質(zhì)粒通過免疫接種

7、BALB/c小鼠，測定對照組與免疫組小鼠抗弓形蟲總IgG、IgG1、IgG2a和細胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ的水平，評估了其刺激產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫的能力;通過弓形蟲速殖子攻擊實驗觀測小鼠的生存時間評估了其免疫保護性。
　　 結(jié)論:通過免疫熒光定位的方法觀察了弓形蟲蛋白酶TgASP1和TgASP3在弓形蟲蟲體內(nèi)外的表達位置及相對表達量，其中TgASP1是一種膜蛋白，主要表達于弓形蟲蟲體頂部區(qū)域，表達區(qū)域高度集中，不

8、呈細胞溶質(zhì)狀態(tài)，并且與弓形蟲的主要分泌器官，包括棒狀體、微線體和致密顆粒不在同一區(qū)域，可能存在介于高爾基體和內(nèi)膜復合物之間的一個新的獨立的區(qū)域;TgASP3蛋白幾乎不在膜上分布，主要分布在細胞質(zhì)中且呈現(xiàn)一定的細胞溶質(zhì)狀態(tài)，結(jié)合弓形蟲的細胞結(jié)構(gòu)，可以明顯看出TgASP3主要分布在弓形蟲蟲體中部的高爾基體區(qū)域內(nèi)，推測可能存在于高爾基體中。通過制備上述4種蛋白酶的重組DNA疫苗證實它們均可誘導較強的體液免疫和細胞免疫，并可顯著增強小鼠抗弓形蟲