出血性中風“瘀熱證”分子基礎及涼血通瘀方對其干預機制研究.pdf

1、出血性中風病情危重，變化多端，是世界上第一位致殘原因和第二位致死原因。探討出血性中風急性期有效的治療方法對降低病死率、致殘率，提高治愈率至關重要。目前西醫(yī)內科常規(guī)治療出血性中風除脫水降低顱內壓、預防應激性消化道出血、控制感染等對癥治療外，尚無療效確切的新方法，運用中醫(yī)藥防治出血性中風急性期的報道較多，顯示出傳統(tǒng)醫(yī)學的獨特優(yōu)勢。國醫(yī)大師-周仲瑛教授認為“瘀熱阻竅”是出血性中風急性期的基本病機，并確立了涼血通瘀為基本治療大法，該法融涼血、散

2、瘀、清熱、通腑、通絡、開竅諸法于一爐，取得了良好的臨床效果。
　　 本論文是國家科技部973計劃——“‘瘀熱’病因在內科難治病發(fā)病中的機制及其分子基礎研究”項目中的部分研究內容，旨在探討出血性中風瘀熱證的分子基礎以及涼血通瘀方的干預機制。
　　 論文總體分為兩大部分：
　　 第一部分:文獻綜述
　　 對出血性中風的一般情況，分子機制研究進展，中醫(yī)藥治療現(xiàn)狀和涼血通瘀方及其活性成分的臨床與實驗研究進行了概述

3、。
　　 第二部分:實驗研究
　　 研究目的：
　　 臨床試驗部分通過分析比較出血性中風瘀熱證與非瘀熱證患者檢測指標的異同，揭示“瘀熱”復合病理因素的特質；并通過比較對照組和試驗組患者用藥前后凝血與炎癥相關指標的變化，探索涼血通瘀法的療效機制；細胞實驗通過建立血管內皮細胞氧化損傷模型，探討涼血通瘀方含藥血清及其活性成分對過氧化氫(H2O2)誘導損傷的血管內皮細胞的保護作用及作用機制，為臨床應用提供客觀依據(jù)。

4、>　　 研究方法：
　　 1、臨床試驗：運用ELISA法檢測凝血相關指標(凝血酶，纖溶酶PAF，SPECAM)和炎癥相關指標(IL-1,4，6，8，10，13，TNF-a，HSP70，NF-KB)：試劑盒法檢測NO、NOS的表達，應用中位數(shù)法(M±Q)統(tǒng)計分析瘀熱和非瘀熱患者之間，對照組和試驗組治療前后、以及涼血通瘀方對瘀熱證患者治療前后的差異，揭示瘀熱證的本質，探討涼血通瘀方療效機制；并通過基因芯片和實時定量PCR挖掘和驗證

5、相關基因(MMP23B、DNAJB14、IL2RA、C1QTNF3、PDGFRB、F8、F2)和信號通路分子的表達情況，尋找作用靶點。
　　 2、藥物化學分析：通過HPLC和UHPLC-MS/MS檢測涼血通瘀方含藥血清中大黃素和大黃酸的濃度，確定大黃酸和大黃素為復方含藥血清中的有效活性成分。
　　 3、細胞實驗：通過MTT法觀察涼血通瘀方含藥血清、有效活性成分不同劑量對細胞活性的影響，篩選出藥物的有效作用劑量；熒光分析術

6、、電鏡和流式細胞術檢測不同劑量藥物組的細胞凋亡情況；試劑盒法檢測各組SOD、MDA、NO和NOS的表達；Rt-PCR和Westemblot法檢測相關基因p53、p21和相關蛋白(NF-KB、Caspase3、P21、P53)的表達，探討涼血通瘀方對血管內皮細胞的保護作用及作用機制。
　　 研究結果:
　　 1、臨床試驗結果：
　　 (1)、初步揭示了出血性中風急性期瘀熱證的分子本質，結果表明：瘀熱患者與非瘀熱患者

7、相比，血小板活化因子、IL-1、IL-4、IL-10、MMP9和NF-(K)B顯著升高；凝血酶活力、IL-6、TNF-a、HSP-70、HSP-27有升高的趨勢。基因芯片檢測結果顯示，瘀熱組與非瘀熱組比，多條炎癥與凝血相關因子編碼基因表達上調，差異表達的基因涉及到多條通路，其中主要是炎癥相關通路，也有部分凝血相關通路涉及血管生成、細胞凋亡、DNA損傷修復、免疫、細胞周期等信號通路。實時熒光定量PCR結果表明TNFRSF18、CIQTNF

8、3、TNFAIP3、TNFRSF25、TRAFI、DNAJB14、HSF2等基因“瘀熱”患者表達顯著高于“非瘀熱”患者。
　　 (2)、探討了涼血通瘀方的藥效作用及作用機制，結果表明：該方能使瘀熱患者凝血酶水平有降低的趨勢；降低瘀熱患者HSP70和TAT水平；促進瘀熱阻竅證患者血管內皮NO的分泌；對多條基因有調控作用；能夠下調多個炎癥與凝血相關因子編碼基因的表達水平，對與p53、p21基因表達有影響，對細胞凋亡相關基因有影響，這

9、些基因涉及凝血、炎癥、免疫、細胞凋亡、細胞周期等多條信號通路，實時定量PCR驗證表明經涼血通瘀方聯(lián)合基礎療法治療后TNFRSF18、CIQTNF3、TNFAIP3、TRAF1、DNAJB14、HSF2等基因表達明顯降低了。
　　 2、藥物化學分析結果：
　　 HPLC和UHPLC-MS/MS檢測結果表明了復方含藥血清高、中、低劑量均含有一定的藥物成分，含有大黃素和大黃酸兩種有效活性成分，為后續(xù)實驗的開展提供了有力的理論和

10、實驗依據(jù)。
　　 3、細胞實驗結果：
　　 涼血通瘀方對H2O2誘導損傷的血管內皮細胞有一定的保護作用。可以改善細胞形態(tài)：促進細胞增殖；抑制細胞凋亡；提升SOD和NOS的活力；提高血管內皮細胞分泌NO的能力；其中中劑量組的藥物能顯著降低p53、p21基因和NF-KB、P53、caspase-3和P21蛋白的表達，減輕H2O2對血管內皮細胞的損傷。
　　 小于15uM的大黃素和小于lOuM的大黃酸可以拮抗H2O2對

11、血管內皮細胞造成的損傷。促進細胞增殖，并呈現(xiàn)一定的量效關系；提升SOD和NOS酶的活力；增加NO含量和降低MDA的生成，尤其是5.OuM劑量的大黃素和1.25uM的大黃酸作用效果明顯，結果表明該劑量藥物能抑制內皮細胞發(fā)生凋亡，降低P53基因和NF-KB、P53、caspase-3、P21蛋白的表達，保護血管內皮細胞免受損傷，維持其正常結構和功能。
　　 結論：
　　 1、出血性中風“瘀熱”患者在凝血系統(tǒng)的激活、腦水腫及炎

12、癥發(fā)生程度、炎癥和凝血相關基因和信號通路分子表達等方面與“非瘀熱”患者存在明顯差異，揭示了出血性中風急性期“瘀熱阻竅證”的本質與凝血、炎癥病理的相關性，因血行凝滯不暢導致“瘀”，機體炎性反應導致“熱”是出血性中風“瘀熱阻竅”證的本質。
　　 2、涼血通瘀方影響出血性中風患者凝血和炎癥相關指標的表達，緩解血瘀，控制炎癥；降低瘀熱患者HSP70的表達，改善患者整體狀態(tài)，減輕機體損傷；增強NO分泌，舒張血管，改善病情；降低TAT水平，

13、減輕繼發(fā)性病理損害，改善ICH患者的預后；調控與凝血、炎癥、免疫和凋亡等有關的基因和信號通路，提高臨床治療效果。
　　 3、涼血通瘀方及其活性成分對H2O2誘導損傷的血管內皮細胞有保護作用，其中中劑量（臨床等效量）作用效果好于高、低劑量組,5.0uM劑量的大黃素和1.25uM的大黃酸作用效果較為顯著，它們的作用機制主要與抑制內皮細胞凋亡、抑制p53、p21等基因的表達，降低NF-(K)B、P53、caspase-3、P21蛋白的

14、表達有關，我們推測保護血管內皮細胞是涼血通瘀方治療出血性中風的可能途徑之一，而大黃酸和大黃素可能是涼血通瘀方發(fā)揮藥效的主要活性成分之一。
　　 本研究通過臨床和實驗研究，以周仲瑛教授的“瘀熱”創(chuàng)新學說為指導，進行瘀熱相搏證本質的探討，闡明涼血化瘀治法方藥的作用機理，實驗對象包括臨床標本和體外細胞株；實驗用藥涉及復方和活性成分；實驗選用細胞生物學、分子生物學技術，實驗反證了“瘀熱”的分子基礎，驗證了涼血通瘀方的現(xiàn)代機制，本研究具有