條紋斑竹鯊再生肝臟中差異RNA的研究.pdf

1、條紋斑竹鯊，是一種比較有代表性的軟骨魚(yú)類，其肝臟比重占到內(nèi)臟比重的3/4的。據(jù)研究報(bào)道，鯊魚(yú)肝臟體內(nèi)含有許多生物活性物質(zhì)，包括了多種肝再生相關(guān)的刺激因子，但沒(méi)有肝臟microRNA的相關(guān)報(bào)道。由于micro RNA和基因組信息的缺乏，也影響了對(duì)鯊魚(yú)肝再生調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的深入研究。
　　本研究構(gòu)建了條紋斑竹鯊1/3肝切除模型，提取正常和再生3h肝組織的RNA，應(yīng)用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)條紋斑竹鯊正常和再生肝臟進(jìn)行microRNA

2、測(cè)序以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)microRNA測(cè)序，鑒定出670條microRN As(290條knownmicroRNAs和380條PC microRNAs)，這些micro RNA隸屬于145個(gè)基因簇;通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得339998條Unigenes，其中有60047條Unigenes，能注釋到基因信息。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行初步分析，主要篩選肝再生過(guò)程中差異表達(dá)的基因和microRNAs，進(jìn)一步闡釋肝再生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要篩選依據(jù)是正常和再生3h

3、肝組織中microRNA和Unigene的Fold Change的比值，共篩選到119條差異表達(dá)的microRNAs以及4754個(gè)差異表達(dá)的Unigenes。一方面以注釋上基因信息的Unigenes作為靶基因庫(kù)，利用miRanda和Targetscan對(duì)119條差異microRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，將這些候選靶基因進(jìn)行GO功能以及KEGG富集分析，以P＜0.01為閾值，篩選顯著富集的GO注釋以及信號(hào)通路，其中GO注釋可映射到28個(gè)cla

4、sses，其中包含了“cell division”、“cell cycle”以及“G2/Mtransition of mitotic cell cycle”;篩選出來(lái)8條顯著富集的信號(hào)通路，其中包含了“Cell Cycle”和“JAK-STAT signaling pathway”。另一方面通過(guò)Real-Time PCR分析microRNA以Unigene在正常和再生3h肝組織中差異表達(dá)情況，驗(yàn)證了5條microRNAs以及3條Unig

5、enes在正常和再生3h肝組織中具有2倍以上的差異。其中包括4條上調(diào)microRNAs和1條下調(diào)microRNA以及3條下調(diào)Unigenes（ICA、GSTP1和PDRX5）。然后通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件分析驗(yàn)證具有差異表達(dá)的microRNAs和Unigenes的靶向性，發(fā)現(xiàn)其中3條microRNAs(PC-5p-13888_168、xtr-miR-34b_L-1 R+1和tni-miR-144)和3條Unigenes（1CA、GSTP1和P

6、DRX5）具有靶向作用，進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告法驗(yàn)證，將ICA、GSTP1和PDRX5的3'UTR全長(zhǎng)序列以突變及種子序列結(jié)合位點(diǎn)的3'UTR插入到psiCHECK2載體中，通過(guò)與對(duì)應(yīng)的micro RNA mimics，轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染Huh7肝癌細(xì)胞，根據(jù)海腎熒光素酶的表達(dá)活性，找出PC-5p-13888_168、 xtr-miR-34b_L-1R+1和tni-miR-144的靶基因。通過(guò)SPSS軟件分析，結(jié)果顯示xtr-miR-34b_