大鼠肝臟再生的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、肝臟是功能復雜的消化器官，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類等生物大分子的代謝、解毒、分泌等重要功能。所以肝臟極易受到外界有害物質(zhì)的損傷，但是它具有很強的再生功能，在正常生理狀態(tài)下或輕度肝損時肝細胞就已經(jīng)參與增殖和分化來維持肝臟的正常功能。肝臟再生與肝相關(guān)疾病密切相關(guān)，它不僅是判斷肝病嚴重程度的一種手段，在臨床上也是作為治療肝臟疾病的一種途徑，合并有脂肪肝、肝硬化等疾病的肝臟再生能力減弱，特別是肝硬化患者術(shù)后再生能力極差，肝臟功能不易恢復

2、導致肝功能衰竭發(fā)生率增高。而肝細胞癌也是由于在肝臟細胞再生過程中增生異常出現(xiàn)惡變。研究發(fā)現(xiàn)利用肝細胞在體內(nèi)旺盛的再生能力可有效實現(xiàn)受損肝組織功能修復和重建。如何選擇增生旺盛的肝細胞進行移植以及如何促進肝再生治療不同種肝臟相關(guān)疾病成為目前研究的熱點之一。因此，對肝臟再生進行深入的研究，進一步了解其機制，來指導臨床肝病的診治，對提高患者生存期具有極其重要的指導意義。 肝臟部分切除術(shù)是肝臟再生最常見的實驗模型，通過觀察肝臟部分切除術(shù)后

3、殘余肝臟基因、蛋白表達情況是了解肝臟再生機制的重要手段。其他的諸如門靜脈結(jié)扎術(shù)、門體靜脈分流術(shù)、直接補償性增生以及藥物誘導也是常用的肝臟再生實驗模型。實驗動物從小型動物如鼠到大型動物狗、豬等，它們在研究肝臟再生過程中各有優(yōu)缺點。一般根據(jù)所需實驗目的來選擇實驗動物。 研究發(fā)現(xiàn)肝臟再生的發(fā)生發(fā)展是由體內(nèi)多基因參與、多步驟協(xié)同的復雜過程。盡管基因表達庫的分子研究方法描述了肝臟切除術(shù)后剩余肝臟迅速激活的信號轉(zhuǎn)導途徑。并已鑒定出超過100

4、個瞬時基因參與肝臟再生，但是目前肝臟再生的分子機制仍不十分清楚，盡管所有的細胞都擁有同樣的基因組，但在不同的細胞內(nèi)會有不同的基因處在活躍狀態(tài)，從而合成不同的蛋白質(zhì)。同樣，不同細胞的差異在很大程度上也是由功能基因及其合成蛋白質(zhì)的不同來決定的，因而需要在整體水平上分析肝細胞內(nèi)蛋白的動態(tài)變化。隨著后基因組時代的到來，以雙向電泳、質(zhì)譜分析為主的蛋白質(zhì)組學的方法和手段為肝臟研究提供了良好的技術(shù)平臺，蛋白質(zhì)組研究直接定位于蛋白質(zhì)水平，從整體、動態(tài)、

5、定量的角度去研究肝臟再生過程中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變。有助于在分子水平上進一步揭示肝臟再生的秘密。 本試驗通過蛋白質(zhì)組的方法，對肝臟再生過程中的蛋白質(zhì)進行比較分析，尋找肝臟再生過程中出現(xiàn)的差異蛋白，來獲取肝臟再生的影響因子，并對部分肝臟切除術(shù)及蛋白質(zhì)組學在研究肝臟再生上的應用進行評價。 一、肝臟再生模型的構(gòu)建和樣品蛋白的提純 目的運用部分肝臟切除術(shù)來構(gòu)建肝臟再生模型，并使用Plusone2-Dclean-up試劑

6、盒來提純肝臟組織樣品蛋白，從而對部分肝臟切除術(shù)在肝臟再生上的應用進行評價。方法SD大鼠行2/3肝臟切除術(shù)，術(shù)后提取肝臟蛋白使用Plusone2-Dclean-up試劑盒處理。處理前后的樣品分別進行第一向等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離至各自的等電點；再進行第二向電泳，在沿垂直的方向進行相對分子(molecular，Mr)質(zhì)量的分離，最后進行銀染顯示蛋白的分布。比較處理前后的電泳圖譜。結(jié)果通過對Plusone2-Dclean-up試劑盒提純

7、前后的2-DPAGE圖譜進行分析，我們可以看到兩者的蛋白表達圖譜大體相似，提純組條紋減少，背景清晰。結(jié)論通過Plusone2-Dclean-up試劑盒有效去除一些干擾物質(zhì)如去垢劑，鹽類、脂類等，可以減少一些干擾物質(zhì)對2-D圖譜的質(zhì)量的影響。 二、肝臟再生過程中蛋白表達差異的研究 目的本部分試驗主要是研究肝臟再生過程中蛋白質(zhì)的表達差異，尋找影響肝臟再生的因子，進一步了解肝臟再生的分子機制，為指導臨床肝病的診治提供依據(jù)。方法

8、試驗分為8組：0h、2h、12h、24h、36h、48h、72h、1w共8個時間點。取大鼠部分肝切除術(shù)后8個時間點的殘余右肝組織各5例，大鼠均來源于第二軍醫(yī)大學動物實驗中心，體重在200-250g。通過組織裂解緩沖液來提取肝臟總蛋白，并進行Plusone2-Dclean-up處理。使用Bradford法測定濃度，各自取300ug蛋白，經(jīng)過水化過夜，在相同條件下進行雙向電泳，最后進行快速銀染顯示蛋白點的分布。所得圖像借助圖像分析軟件Ima

9、gemaster2DElite進行分析，選取顯著動態(tài)變化進行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，并借助互聯(lián)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索程序Mascot，通過NCBInr蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行檢索。選取有意義的蛋白點進行Western-blotting證實。結(jié)果每塊膠中分別檢測到1200±20個蛋白點。我們發(fā)現(xiàn)78個有動態(tài)變化的蛋白點，通過質(zhì)譜鑒定出38個有意義的蛋白。結(jié)論通過蛋白質(zhì)組的方法，我們對肝臟再生的差異蛋白進行了比較，得到了一系列有意義的蛋白，

10、所鑒定的蛋白分別涉及到幾種不同的代謝途徑：氧化應激反應、急性期反應蛋白、脂類代謝蛋白、能量代謝的酶類、參與信號傳導、參與蛋白代謝、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、功能未知等。并對Prohibitin和Regucalcin兩種蛋白在肝臟再生中的作用進行探討。 小結(jié)：本課題通過比較Plusone2-Dclean-up試劑盒處理前后的肝臟組織的雙向電泳圖譜，證實了Plusone2-Dclean-up試劑盒在不影響總蛋白量的情況下能夠有效的提純蛋白，減少