雄激素受體基因CAG重復序列多態(tài)性及雄激素與動脈粥樣硬化關系的初步研究.pdf

1、男性冠心病的發(fā)病率和病死率均明顯高于同齡絕經(jīng)前女性。近年來有關雄激素在男性動脈粥樣硬化性疾病包括冠心病發(fā)病中的作用逐漸受到關注。有研究顯示，男性冠心病患者血循環(huán)睪酮水平明顯降低；長期口服高劑量睪酮制劑或經(jīng)皮補充低劑量睪酮可改善男性心絞痛癥狀積分和心肌缺血的客觀指標；在男性冠心病患者冠脈內注入生理濃度睪酮可增加冠脈直徑和冠脈內血流；動脈粥樣硬化好發(fā)于老年男性，而老年男性睪酮水平明顯降低，提示睪酮與動脈粥樣硬化之間存在關聯(lián)。匯總，臨床流行病

2、學研究的結果，沒有研究支持睪酮與冠心病的正相關。血管內皮細胞的OX-LDL氧化損傷是動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中重要的始動環(huán)節(jié)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在心房、心室肌纖維、動脈內皮細胞及血管平滑肌細胞均有雄激素受體(AR)表達。雄激素只在AR存在的靶組織中才能行使其生物學功能，雄激素作用的強弱與細胞內AR含量密切相關。研究顯示，AR的表達和功能受AR基因外顯子1區(qū)(CAG)n多態(tài)性的調控。因此要研究雄激素對動脈粥樣硬化的影響，AR是關鍵環(huán)節(jié)，而AR基因(C

3、AG)。多態(tài)性與雄激素和冠心病的關系并不明確。本研究旨在通過對雄激素-雄激素受體-動脈粥樣硬化三者之間關系的研究，以及雄激素受體基因CAG多態(tài)性對AR表達影響的研究，從基因和細胞水平探討AR在動脈粥樣硬化中發(fā)揮的作用。 目的： (1)研究AR基因(CAG)n多態(tài)性對AR mRNA和AR蛋白表達的影響； (2)研究不同濃度的睪酮預處理對ECV304氧化損傷后NO、PAI-1、ICAM-1、PDGF-B和TGF-β1

4、的變化，探討睪酮在動脈粥樣硬化中可能的作用機制。 (3)研究含不同CAG重復數(shù)AR基因的ECV304氧化損傷后，睪酮干預治療作用的差別。 方法： (1)以pwtAR質粒和已鑒定CAG重復數(shù)的白細胞基因組DNA為基礎，通過重組PCR、酶切、連接等方法構建含CAG重復數(shù)為0，8，21，34的AR表達質粒； (2)將含CAG重復數(shù)0，8，21，34的AR表達質粒轉染HEK293細胞，TRIZOL提取總RNA，用

5、于RT-PCR檢測AR mRNA；細胞裂解液提取總蛋白，用于Western Blot檢測AR蛋白。分析并比較不同的CAG重復對AR轉錄及翻譯的影響； (3)MTT法檢測不同濃度睪酮干預對ECV304細胞增殖的影響，連續(xù)觀察96h； (4)RT-PCR比較不同濃度睪酮干預后ECV304細胞AR mRNA水平的差別； (5)ECV304細胞分組，分別加入OX-LDL、不同濃度睪酮預處理+OX-LDL和氟他胺(Flu，

6、AR拮抗劑)預處理+OX-LDL，孵育30h后，收集培養(yǎng)液上清，硝酸還原酶法檢測NO，ELISA法檢測PAI-1；收集細胞加裂解液提取蛋白，Western Blot檢測ICAM-1、PDGF-B和TGF-β1； (6)將含CAG重復數(shù)0，8，21，34的AR表達質粒轉染ECV304細胞，之后用OX-LDL氧化損傷12h，加不同濃度的睪酮干預24h，按照步驟(5)中的方法檢測相應指標。 結果： (1)成功構建了含C

7、AG重復數(shù)為0，8，21，34的AR表達質粒，經(jīng)酶切、測序和序列比對，證實插入片段的大小、方向、閱讀框和CAG重復長度正確； (2)CAG重復數(shù)與AR mRNA和蛋白水平之間的關系：對AR mRNA，CAG0最低，CAG34居中，CAG8和CAG21最高；對AR蛋白，CAG8最低，CAG34居中，CAG0和CAG21最高。二者的變化并不一致； (3)低生理及生理濃度(3～30nM)的睪酮對內皮細胞的生長無不良影響；而超生

8、理濃度睪(3μM-30μM)36h后，高生理濃度睪酮(300nM)48h后內皮生長速度減慢。隨著睪酮作用時間的延長差別越發(fā)明顯，生長曲線增長幅度明顯變緩； (4)ECV304細胞AR mRNA轉錄水平隨睪酮濃度的增加而增加，在低～高生理濃度范圍(3nM～300nM)內基本一致，在超生理濃度(3～30μM)表達量進一步增加； (5)不同濃度睪酮預處理對OX-LDL氧化損傷ECV304細胞后各指標檢測的結果：OX-LDL引起

9、NO、TGF-β1表達降低，PAI-1、ICAM-1和PDFGF-B表達增加；與OX-LDL組相比，T3nM和T30nM預處理除對PAI-1和ICAM-1表達無逆轉作用外，PDGF-B進一步降低，而在NO和TGF-β1的影響上前者繼續(xù)下降，后者有增加作用；T300nM～30μM作用相似，對ICAM-1和PDGF-B有抑制作用，對TGF-β1有促進作用，但T3～30μM對NO和PAI-1的變化無明顯逆轉；Flu預處理對PAI-1無明顯影響

10、，對其他OX-LDL損傷指標的變化有拮抗作用； (6)ECV304細胞轉染pAR-CAGn的效果不理想，未能就AR基因(CAG)n多態(tài)性對氧化損傷的內皮細胞(動脈粥樣硬化模型)的影響作更加深入的研究。 結論： (1)重組PCR是可行的、有效的基因重組和基因缺失突變方法； (2)在本研究所選取的CAG重復數(shù)上，未發(fā)現(xiàn)CAG重復數(shù)(0，8，21，34)與AR mRNA和蛋白水平之間的線性關系，在CAG21的A

11、R mRNA和蛋白表達量均較高，與人群中CAG重復數(shù)的中位數(shù)相近； (3)超生理濃度睪酮對ECV304的細胞增長有明顯的抑制作用； (4)睪酮對ECV304 AR mRNA的表達有劑量依賴性增加的作用； (5)低生理濃度睪酮對氧化損傷的ECV304無保護作用，而生理濃度、高生理濃度和超生理濃度的睪酮對氧化損傷的ECV304保護的機制不盡相同。氟他胺(AR拮抗劑)對氧化損傷的ECV304也有保護作用，確切的機制不明