雄激素-雄激素受體軸調控Nanog基因對腫瘤細胞干性影響及機制研究.pdf

1、雄激素/雄激素受體信號軸作為一普遍存在于人體細胞內的信號通路，除起到促進男性發(fā)育與性征維持的關鍵作用外，也參與了細胞代謝與免疫調節(jié)等生理過程。此外，越來越多的研究證實，其還對細胞的增殖，凋亡等生命活動過程起到了廣泛的調控作用。但同時，也因其具有上述廣泛高效的調控作用，雄激素信號軸在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色長期以來被眾多研究所關注。
　　前期，在腫瘤研究中，因雄激素信號軸本身作為與男性生理調節(jié)密切相關的信號通路，一直以來大量的研究

2、主要集中于男性生殖系統(tǒng)腫瘤例如前列腺癌中。但隨著研究的深入，越來越多與激素相關的腫瘤被發(fā)現(xiàn)與其存在密切聯(lián)系。這其中，卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，之前的研究較少將其與雄激素關聯(lián)，但作為重要的性激素合成與分泌器官，其組織中除存在大量的雌孕激素外，還存在高水平的雄激素，而近年來，雄激素/雄激素受體軸與卵巢癌發(fā)生發(fā)展間的關聯(lián)被不斷認識與探索。而另一比較特殊的腫瘤——肝癌，其發(fā)生率存在明顯的性別偏倚，即全世界范圍內，在排除環(huán)境及生活習慣等外在

3、因素影響的情況下，男性的發(fā)病率也明顯高于女性。雖然肝臟作為人體重要的代謝器官并不直接參與性激素的合成，但其是性激素代謝的重要場所，其微環(huán)境中雄激素水平也較一般非性腺組織高。
　　目前，卵巢癌患者5年生存率僅為40％，死亡率高居婦科腫瘤之首，其不良預后與卵巢癌細胞的耐藥、復發(fā)密切相關，但該過程中的具體原因尚不完全清楚;與此同時，肝癌作為惡性程度較高的腫瘤，其5年生存率在所有腫瘤中也處于較低水平。因此對卵巢癌和肝癌發(fā)生發(fā)展的相關影響因

4、素及機制的研究有著重要的理論與應用價值。而兩者與雄激素之間的關聯(lián)，使得我們對雄激素/雄激素受體軸在卵巢癌及肝癌等性激素相關性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的共性作用產(chǎn)生興趣。
　　近年來，隨著對腫瘤生物學行為和特征的不斷認識，眾多研究證實，腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells，CSCs)在腫瘤各階段的進程中扮演了十分關鍵的角色，其通過不斷的自我更新及有效地抵抗外來損害等機制，成為腫瘤發(fā)生、耐藥及復發(fā)等環(huán)節(jié)的關鍵因素。而腫瘤干細胞存在一

5、個動態(tài)演變的過程，在腫瘤生長的同時，其內的干細胞也面臨分化的壓力;同時，一部分非腫瘤干細胞在各種因素影響下又可以逆分化為具有腫瘤干細胞樣特征的細胞。因此，調控腫瘤細胞干性的相關因素及機制成為目前抗腫瘤研究的重點之一。
　　介于雄激素信號軸與卵巢癌及肝癌等激素相關性腫瘤間的關聯(lián)，以及腫瘤干細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要地位，我們對雄激素/雄激素信號軸是否參與惡性腫瘤細胞的干性調控產(chǎn)生了興趣。本課題組前期研究證實干性基因Nanog可以作為

6、腫瘤干細胞標記，并在腫瘤細胞的干性調控中發(fā)揮了重要的調控作用;而另一方面，根據(jù)相關文獻報道雄激素受體能夠促進Nanog基因的表達。所以，結合相關實驗及理論基礎，本課題中，我們對雄激素/雄激素受體信號軸對腫瘤細胞干性的影響，及其作用背后的相關機制等問題進行了探討與研究。
　　本文主要的研究方法及結論如下:
　　1.證實在卵巢癌及肝癌組織中雄激素受體(androgen receptor，AR)存在異常高表達，且其表達與腫瘤干性標

7、記Nanog間存在關聯(lián)
　　(1).證實了AR在卵巢癌及肝癌組織較對應的正常組織明顯高表達。通過對卵巢癌及肝癌臨床組織標本進行免疫組織化學染色和Western blot檢測證實:AR在卵巢癌及肝癌組織中表達較對應的正常組織明顯增高。(2).AR與Nanog表達在腫瘤組織中存在相關性。通過Western blot，我們進而檢測了Nanog的表達量，其在腫瘤組織中也較正常組織高表達。通過皮爾森相關性分析證實，AR與Nanog在腫瘤組織

8、中的表達存在相關性。
　　2.通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建內源性Nanog基因標記細胞模型，證實AR與Nanog在細胞中表達趨勢一致且存在共定位。
　　(1).通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建內源性Naong基因標記細胞模型。首先，進行gRNA設計和利用BbSI酶切構建了Nanog基因CRISPR/Cas9+gRNA打靶載體;同時，采用PCR，限制性核酸內切酶酶切及Gibson克隆等方法構建了Nanog-2A-GFP

9、重組同源臂質粒。通過對卵巢癌及肝癌細胞系分別同時轉染上述兩種質粒，我們利用細胞自身的同源重組修復機制將GFP綠色熒光蛋白編碼基因重組入了Nanog編碼區(qū)的后方，并通過流式細胞分選GFP陽性單克隆細胞進行單克隆細胞培養(yǎng)，進而進行PCR，酶切及測序鑒定，篩選了打靶正確的GFP標記Nanog單克隆細胞株。(2).檢測Nanog基因打靶細胞不同細胞亞型生物學功能差異。首先，通過流式細胞分選同株細胞中GFP(+)及(-)細胞，并經(jīng)過RT-PCR及

10、Western blot檢測證實，在GFP(+)細胞中，Nanog基因表達在mRNA及蛋白水平都明顯高于GFP(-)細胞;其次，通過體外細胞成球及克隆形成實驗證實GFP(+)細胞成球及克隆形成等干性指標較GFP（-）明顯增高;最后通過小鼠體內成瘤實驗進一步證實GFP(+)細胞的腫瘤形成能力明顯高于GFP（-）細胞。(3).在單克隆細胞株中證實AR與Nanog表達存在一致性，且兩者在細胞中存在共定位。通過RT-PCR及Western bl

11、ot檢測證實了AR與Nanog在細胞中的表達在轉錄及蛋白水平都具有一致性，且都在GFP(+)細胞表達高于GFP(-)細胞;進而通過激光共聚焦對兩者進行免疫熒光的共定位檢測，證實兩者在GFP(+)細胞中存在共定位而在GFP（-）中無表達。
　　3.揭示雄激素信號軸通過促進Nanog基因表達對腫瘤細胞干性產(chǎn)生的調控作用及機制。
　　(1).證實雄激素信號軸能夠調控Nanog基因表達。利用雙氫睪酮(DHT)刺激或者雄激素受體促降解

12、劑(ASC-J9)抑制雄激素信號軸的活性，通過RT-PCR及Westernblot檢測AR及Nanog基因在mRNA及蛋白水平的表達變化情況證實，在DHT刺激后細胞的AR與Nanog基因mRNA及蛋白表達都明顯增高，而DHT的該作用能夠被ASC-J9抑制。(2).證實雄激素信號軸能夠調控腫瘤細胞干性。通過DHT和(或)ASC-J9對GFP(+)及（-）細胞進行處理，證實激活雄激素處理能夠明顯增強細胞的克隆形成及成球能力，而抑制該信號軸能

13、夠逆轉該作用。(3).證實雄激素信號軸對于腫瘤細胞干性的調控是通過Nanog介導的。通過慢病毒載體對單克隆細胞株進行Nanog基因過表達及敲低，建立Nanog過表達及敲低細胞系，進而分別對Nanog敲低細胞株中進行DHT處理和對Nanog過表達細胞進行ASC-J9處理，檢測兩者的成球和克隆形成等干性指標，結果顯示DHT不能增強Nanog敲低細胞株的干性，而ASC-J9對于Nanog過表達的細胞干性下調作用也不明顯。(5).證實AR能夠直

14、接結合Nanog啟動子區(qū)，激活其啟動子活性進而上調其表達。首先，我們通過序列片段分析證實Nanog啟動子上存在AR特異性結合序列，并通過染色質免疫共沉淀(ChIP)證實AR與Nanog啟動子相應區(qū)域的特異性結合能力。其次，通過構建Nanog啟動子區(qū)不同區(qū)域的熒光素酶報告基因慢病毒載體，并感染相應細胞系，獲得了具有Nanog啟動子活性報告系統(tǒng)的細胞株;進而對細胞進行DHT和（或）ASC-J9處理后檢測其熒光素酶活性，證實AR與Nanog啟

15、動子區(qū)的結合能夠激活其轉錄活性。
　　4.動物體內實驗驗證雄激素/雄激素受體信號軸的促瘤作用
　　(1)構建去勢裸鼠模型。通過摘除裸鼠雙側睪丸構建去勢小鼠模型，進而將該去勢小鼠分為去勢組和去勢補充雄激素治療組。(2).分組建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察統(tǒng)計未處理組，去勢組及去勢補充雄激素治療組后腫瘤生長及體積，證實去勢組腫瘤體積較其他兩組明顯減小。(3).證實雄激素在體內能夠促進Nanog表達，且AR與Nanog在組織中存在共

16、定位。通過移植瘤連續(xù)切片免疫組化檢測證實未處理組及補充雄激素組切片中Nanog及AR明顯高表達，且兩者存在組織細胞共定位。
　　綜上，本研究的結論主要可歸納為:
　　1.AR在卵巢癌及肝癌組織及細胞中異常高表達，且與干性基因Nanog的表達存在一致趨勢，兩者表達也存在正相關關系。
　　2.雄激素信號軸能夠通過AR直接綁定Nanog啟動子激活其轉錄活性，上調Nanog基因的表達，進而對腫瘤細胞干性起到促進作用，且Nano

17、g是該干性調控作用中的關鍵分子。
　　3.雄激素信號軸能夠促進腫瘤細胞的體內成瘤及生長。
　　綜上，本研究通過探討雄激素信號軸與卵巢癌及肝癌兩種激素關聯(lián)性較高的腫瘤間的作用，證實了雄激素信號軸能夠對腫瘤細胞干性起到促進作用，并通過研究該調控的相關機制，證實干性基因Nanog參與這一過程。本研究一方面豐富了雄激素信號軸與腫瘤發(fā)生發(fā)展間的認識，從腫瘤干細胞層面闡述了相關機制;另一方面也為卵巢癌和肝癌這類與性激素相關的腫瘤的治療提