聚腺苷二磷酸核糖多聚酶在癲癇大鼠海馬損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景 癲癇是嚴(yán)重危害人類健康的慢性腦部疾病之一，我國目前約有900萬癲癇患者，給社會、家庭和個人都帶來了沉重負(fù)擔(dān)。約有20％～30％的癲癇患者用現(xiàn)有的抗癲癇治療方法不能很好地控制發(fā)作，演變?yōu)殡y治性癲癇，顳葉癲癇是其中最常見的一種類型。近年來，對顳葉癲癇的病因、病理及治療等研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但它的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。顳葉癲癇一個重要的病理變化是海馬硬化，表現(xiàn)為神經(jīng)元脫失和膠質(zhì)細(xì)胞增生。癲癇發(fā)作能造成神經(jīng)元損傷已被廣泛認(rèn)

2、可，一般認(rèn)為癲癇發(fā)作可誘導(dǎo)谷氨酸過度釋放，激活谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparate，NMDA)受體，觸發(fā)鈣離子向神經(jīng)元內(nèi)流，激活一氧化氮合酶，產(chǎn)生大量自由基，活化多種與細(xì)胞死亡相關(guān)的蛋白，最終造成神經(jīng)元發(fā)生程序性死亡。目前，癲癇發(fā)作致神經(jīng)元損傷的死亡形式及分子機(jī)制仍不十分清楚，對癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元保護(hù)也缺乏有效手段。 聚腺苷二磷酸核糖多聚酶[poly(ADP-ribose)polymerase，P

3、ARP]是一種存在于真核細(xì)胞中的非組蛋白染色體蛋白質(zhì)，具有蛋白修飾和核苷酸聚合作用，參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、基因調(diào)控、信號傳導(dǎo)及細(xì)胞死亡等過程。在生理狀態(tài)下，PARP催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成大分子聚腺苷二磷酸核糖聚合物，激活DNA修復(fù)系統(tǒng)發(fā)揮基因修復(fù)作用。當(dāng)DNA受損過重時，PARP被過度活化，會耗竭細(xì)胞內(nèi)能量、激活細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白、引起炎癥反應(yīng)。研究證實，PARP與腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病多種疾病密切相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中

4、，PARP-1基因敲除或藥物抑制在腦缺血再灌注、興奮性毒性、腦創(chuàng)傷等病理生理狀態(tài)中也表現(xiàn)出了明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。最近的研究還提示，PARP參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元死亡很可能與凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)信號，蛋白激酶B(proteinkinase B，Akt)依賴的細(xì)胞生存信號，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κ B)相關(guān)的的炎癥信號等有關(guān)。到目前為止，PARP是否參與癲癇誘發(fā)的

5、神經(jīng)元程序性死亡，PARP抑制劑3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide，3-AB)是否對癲癇致海馬損傷具有保護(hù)作用仍未見報道。本研究建立紅藻氨酸(kainic acid，KA)誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型，探討癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元損傷后的病理特征；應(yīng)用PARP抑制劑3-AB進(jìn)行干預(yù)，檢測與細(xì)胞死亡相關(guān)的蛋白和信號分子，探討PARP在大鼠癲癇致海馬損傷中的作用及其分子機(jī)制。 本研究分二部分 第一部分:聚腺苷二磷酸核糖

6、多聚酶在癲癇大鼠海馬損傷中作用的研究 目的:探討KA誘導(dǎo)大鼠癲癇模型海馬神經(jīng)元損傷的病理特征；研究PARP在致癇大鼠海馬組織的變化規(guī)律及PARP抑制劑3-AB對癲癇致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)效果 方法： 1.應(yīng)用立體定向腦室內(nèi)微量注射的方法建立KA誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型。實驗動物在檢測PARP活性時分為對照組、KA致癇2 h、6 h、12 h、24 h、72 h組；在檢測3-AB對PARP抑制作用及對海馬神經(jīng)元保護(hù)作

7、用時分為對照組、KA致癇組、KA+生理鹽水組及3-AB干預(yù)組(KA+3-AB組) 2.應(yīng)用HE染色和Nissl染色觀察各實驗組大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)目改變 3.應(yīng)用電鏡觀察各組大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的形態(tài)特征 4.應(yīng)用免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測PARP活性指標(biāo)聚腺苷二磷酸核糖(PAR)在癲癇發(fā)作后不同時程的變化 5.應(yīng)用Western blot檢測3-AB對癲癇發(fā)作

8、后PARP活性變化的作用. 結(jié)論： 1.KA致癇大鼠海馬神經(jīng)元受損明顯、數(shù)目減少，受損神經(jīng)元表現(xiàn)為壞死樣形態(tài) 2.PARP活性在癲癇發(fā)作后表現(xiàn)出時間依賴性增高，該變化可被3-AB抑制3.3-AB可減輕癲癇發(fā)作造成的海馬神經(jīng)元損傷 第二部分:PARP調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬凋亡誘導(dǎo)因子及蛋白激酶B表達(dá)的研究 目的:探討KA致癇大鼠海馬組織AIF及Akt、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase

9、-3β，GSK-3β)隨時間的變化規(guī)律及PARP對抑制劑3-AB對其的調(diào)節(jié)作用 方法： 1.檢測AIF、Akt及GSK-3β在致癇后大鼠海馬表達(dá)規(guī)律時分為對照組、KA致癇2 h、6 h、12 h、24 h、72 h組；檢測3-AB對AIF的作用時分為對照組、KA致癇組、KA+生理鹽水組及KA+3-AB組；檢測3-AB對Akt及GSK-3β的作用時分為對照組、KA致癇組、KA+生理鹽水組、KA+3-AB組、KA+生理鹽水+

10、二甲基亞砜組與KA+3-AB+LY294002組 2.應(yīng)用Western blot檢測各組大鼠海馬組織AIF、Akt及GSK-3β的表達(dá) 結(jié)論： 1.癲癇發(fā)作可激活海馬組織NF-K,κB，NF-K,κB p65的核轉(zhuǎn)位可被3-AB抑制2.癲癇發(fā)作可引起海馬組織IL-1β、COX-2和MMP-9的表達(dá)增高，3-AB能明顯減少上述炎癥因子的表達(dá)。 2;基質(zhì)金屬蛋白酶9本研究應(yīng)用大鼠顳葉癲癇模型，首次在成體動物