自噬在癲癇大鼠海馬損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景: 癲癇是嚴(yán)重危害人類健康的慢性腦部疾病之一，我國(guó)目前約有900萬癲癇患者，給社會(huì)、家庭和個(gè)人都帶來了沉重負(fù)擔(dān)。約有20％～30％的癲癇患者用現(xiàn)有的抗癲癇治療方法不能很好地控制發(fā)作，演變?yōu)殡y治性癲癇，顳葉癲癇是其中最常見的一種類型。近年來，對(duì)顳葉癲癇的病因、病理及治療等研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但它的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。顳葉癲癇一個(gè)重要的病理變化是海馬硬化，表現(xiàn)為神經(jīng)元脫失和膠質(zhì)細(xì)胞增生。癲癇發(fā)作能造成神經(jīng)元損傷已被廣泛

2、認(rèn)可，一般認(rèn)為癲癇發(fā)作可誘導(dǎo)谷氨酸過度釋放，激活谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-asparate，NMDA）受體，觸發(fā)鈣離子向神經(jīng)元內(nèi)流，激活一氧化氮合酶，產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，活化多種與細(xì)胞死亡相關(guān)的蛋白，最終造成神經(jīng)元發(fā)生程序性死亡。目前，癲癇發(fā)作致神經(jīng)元損傷的死亡形式及分子機(jī)制仍不十分清楚，對(duì)癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元保護(hù)也缺乏有效手段。 細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的維持取決于細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)生物合成與代謝的平衡

3、，這一平衡的打破往往導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自我調(diào)節(jié)以適應(yīng)環(huán)境。真核細(xì)胞存在兩大主要的蛋白質(zhì)降解途徑-蛋白酶體和溶酶體途徑。自噬作為溶酶體降解途徑的形式之一，對(duì)于長(zhǎng)壽命蛋白降解和細(xì)胞器更新發(fā)揮了必不可少的作用。根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)到溶酶體內(nèi)的途徑不同，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的自噬主要有三種不同的類型：①巨自噬（macroautophagy），是最幸要的一類自噬；多數(shù)人認(rèn)為是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的單層膜凹陷形成杯狀雙層膜樣的分隔膜，進(jìn)而完全包繞待降解物形

4、成自噬體，接著與溶酶體融合，自噬體內(nèi)細(xì)胞物質(zhì)如細(xì)胞器被溶酶體酶溶解；該途徑豐要降解不必要的或功能異常的細(xì)胞器和蛋白；②小自噬（microautophagy）：是溶酶體的膜直接包裹如長(zhǎng)壽命蛋白并在溶酶體內(nèi)降解；③分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone mediated autophagy，CMA）：胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中被溶酶體酶消化。細(xì)胞為維持正常的新陳代謝，其生長(zhǎng)過程始終都有自噬現(xiàn)象；而自噬的消長(zhǎng)受多種因素的影響

5、。在正常情況下，自噬在多數(shù)細(xì)胞內(nèi)都處于一個(gè)相當(dāng)?shù)偷乃?。研究表明氧化?yīng)激是自噬重要的誘導(dǎo)因素，作為信號(hào)分子活性氧可激活自噬現(xiàn)象。此外，自噬參與細(xì)胞的死亡過程，自噬是凋亡之外的第二種程序性細(xì)胞死亡方式。 到目前為止，自噬是否參與癲癇誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及在神經(jīng)元程序性死亡中發(fā)揮何種作用；自由基清除劑維生素E對(duì)自噬的影響如何；自噬抑制劑渥曼青霉素（wortmannin，WM）是否對(duì)癲癇致海馬損傷具有保護(hù)作用仍未見報(bào)道。本研究建立P

6、ILO（pilocarpine，PILO）誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型，探討癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元損傷后的自噬現(xiàn)象的病理特征；分別應(yīng)用自由基清除劑維生素E和自噬抑制劑WM抑制劑進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)與自噬相關(guān)的蛋白和信號(hào)分子的變化，探討自噬在大鼠癲癇致海馬損傷中的作用及其分子機(jī)制。本研究分三部分。 第一部分:巨自噬在癲癇大鼠海馬損傷中作用的研究及維生素E對(duì)巨自噬的調(diào)節(jié)作用 目的: 探討PILO誘導(dǎo)大鼠癲癇模型海馬神經(jīng)元損傷的病理

7、特征；研究巨自噬在致癇大鼠海馬組織的變化規(guī)律；探討自由基清除劑維生素E對(duì)巨自噬的影響以及神經(jīng)保護(hù)作用。 方法: 1.應(yīng)用腹腔注射的方法建立PILO誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在檢測(cè)自噬活性時(shí)分為對(duì)照組、PILO致癇2h、8h、16 h、24 h、72 h組；在檢測(cè)維生素E對(duì)巨自噬抑制作用及對(duì)海馬神經(jīng)元保護(hù)作用時(shí)分為對(duì)照組、PILO致病組、維生素E+生理鹽水組及維生素E干預(yù)組（維生素E+PILO組）。 2.觀察

8、PILO誘導(dǎo)的顳葉癲癇大鼠的行為學(xué)變化，致癇成功率，誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)的潛伏期（注射PILO到發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)的時(shí)間）和24小時(shí)的死亡率；觀察維生素E對(duì)癲癇動(dòng)物行為學(xué)的保護(hù)作用。 3.應(yīng)用HE染色、Nissl染色觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)目改變 4.應(yīng)用電鏡觀察各組大鼠癲癇后海馬神經(jīng)元的形態(tài)特征及自噬泡的變化 5.應(yīng)用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)巨自噬活性指標(biāo)微管相關(guān)蛋白輕鏈3（L

9、C3）Ⅱ/LC3Ⅰ的比例、beclin1在癲癇發(fā)作后不同時(shí)程的變化。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)beclin1 mRNA在癲癇發(fā)作后不同時(shí)程的變化。 6.應(yīng)用Western blot檢測(cè)維生素E對(duì)癲癇發(fā)作后巨自噬活性變化的作用 結(jié)果: 1.注射PILO后5～30min出現(xiàn)刻板行為：表現(xiàn)為凝視不動(dòng)、咀嚼、吸鼻或探索行為、濕狗樣震顫、反復(fù)頭頸上仰等，隨后出現(xiàn)面肌痙攣、點(diǎn)頭、單側(cè)或雙側(cè)前肢陣攣、伴直立、

10、跌倒或翻轉(zhuǎn)，最后可發(fā)展至全身強(qiáng)直痙攣持續(xù)狀態(tài)發(fā)作。本組50只大鼠，有45只出現(xiàn)Ⅲ-Ⅴ級(jí)發(fā)作，并最終呈SE（其中存活41只，死亡3只），另外5只未達(dá)到Ⅲ級(jí)反作。待大鼠出現(xiàn)SE發(fā)作后2h，以安定終止后，大鼠處于抑制與消耗狀態(tài)，反應(yīng)與活動(dòng)減少。PILO致癇組15只大鼠14只出現(xiàn)SE，致癇率為93.33％。維生素E干預(yù)組的斂癇率為80％，兩組間無顯著性差異。 2.正常大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，

11、胞漿內(nèi)尼氏小體豐富。癲癇發(fā)作后大鼠海馬神經(jīng)元腫脹、排列紊亂，膜破裂，胞漿尼氏小體減少。維生素E干預(yù)組大鼠海馬大部分錐體細(xì)胞邊緣清晰，形態(tài)正常，僅少量神經(jīng)元染色質(zhì)凝聚、輪廓模糊。 3.大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)日在癲癇發(fā)作24h（75.5±5.92）后較對(duì)照組（110.67±18.56）明顯減少（n=6，P<0.05）；維生素E干預(yù)組大鼠CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)日（94.67±13.03）較PILO組顯著增加（n=6，P<0.05）

12、 4.Western blot研究發(fā)現(xiàn)，大鼠致癇后2h海馬組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及beclin1表達(dá)升高（P<0.05），在24 h達(dá)高峰（P<0.05），并至少持續(xù)增高到72 h（P<0.05）。 結(jié)論: 1.PILO致癇大鼠海馬神經(jīng)元受損明顯、數(shù)目減少，受損神經(jīng)元存在巨自噬激活現(xiàn)象。 2.LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及beclin1表達(dá)活性在癲癇發(fā)作后表現(xiàn)出時(shí)間依賴性增高，該變化可被維生素E部分抑制

13、。 3.維生素E可減輕癲癇發(fā)作造成的海馬神經(jīng)元損傷，延長(zhǎng)致癇潛伏期，提高致癇動(dòng)物的存活率。 第二部分:分子伴侶介導(dǎo)的自噬在癲癇大鼠海馬損傷中作用的研究及維生素E的調(diào)節(jié)作用 目的: 探討PILO致癇大鼠海馬組織分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone mediatedautophagy，CMA）隨時(shí)間的變化規(guī)律及維生素E對(duì)其的調(diào)節(jié)作用 方法: 1.應(yīng)用腹腔注射的方法建立PILO誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲

14、癇模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在檢測(cè)CMA活性時(shí)分為對(duì)照組、PILO致癇2h、8h、16 h、24 h組；在檢測(cè)維生素E對(duì)CMA抑制作用及對(duì)海馬神經(jīng)元保護(hù)作用時(shí)分為對(duì)照組、PILO致癇組、維生素E+生理鹽水組及維生素E干預(yù)組（維生素E+PILO組）。 2.溶酶體的分離和溶酶體膜的提取分離：采用速度離心和密度梯度離心的方式。 3.應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬組織溶酶體膜上和溶酶體基質(zhì)內(nèi)2a型溶酶體膜相關(guān)蛋白（lysoso

15、me-associated membrane protein type2a，LAMP2a）的表達(dá)；應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組大鼠海馬組織LAMP2a的mRNA的水平。 結(jié)論: 1.癲癇發(fā)作可誘發(fā)海馬組織CMA明顯激活，但晚于巨自噬約6小時(shí)，維生素E能明顯抑制癲癇誘發(fā)CMA的激活。 2.癲癇發(fā)作誘發(fā)的CMA的激活是通過LAMP2a的合成增加來實(shí)現(xiàn)的，而不是通過LAMP2a由溶酶體基質(zhì) 第三部分:Wortman

16、nin抑制癲癇大鼠海馬巨自噬活性及神經(jīng)保護(hù)作用的研究 目的: 探討巨自噬抑制劑渥曼青霉素（wortmannin，WM）對(duì)PILO致癇大鼠的行為學(xué)變化，以及對(duì)癲癇大鼠海馬組織巨自噬活性即LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影響，并且探討了磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）在巨自噬中的作用。 方法: 1.應(yīng)用腹腔注射的方法建立PILO誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在檢測(cè)自噬活

17、性時(shí)分為對(duì)照組、PILO致癇2h、8h、16 h、24 h、72 h組；在檢測(cè)WM對(duì)巨自噬抑制作用及對(duì)海馬神經(jīng)元保護(hù)作用時(shí)分為對(duì)照組、PILO致癇24h組及WM干預(yù)組（WM+PILO組）。 2.觀察PILO誘導(dǎo)的顳葉癲癇大鼠的行為學(xué)變化，致癇成功率，誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)的潛伏期（注射PILO到發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)的時(shí)間）和24小時(shí)的死亡率；觀察WM對(duì)癲癇動(dòng)物行為學(xué)的保護(hù)作用。 3.應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬組織