聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶在不同月齡小鼠卵巢上的表達.pdf

1、本研究分為兩部分：1、對性成熟前雌性c57BL/6小鼠給予外源性促性腺激素，誘導其卵泡發(fā)育成熟。檢測PARP-1和PARP-2在小鼠各級卵泡中蛋白及mRNA的表達；初步探討PARP在小鼠卵巢中的定位及其在不同發(fā)育階段卵泡的表達程度，為進一步闡明PARP在卵泡發(fā)育成熟中的作用提供實驗基礎；2、檢測不同月齡雌性c57BL/6小鼠卵巢內(nèi)PARP-1和PARP-2在蛋白及mRNA水平的表達，同時檢測PAR的表達；初步探討PARP及其活性與卵巢功

2、能老化的關系。 材料與方法: 第一部分 將25只3周齡性未成熟的C57BL/6雌性小鼠隨機分為5組，每組5只。5只直接以頸椎脫臼法處死；余下20只予腹腔內(nèi)注射PMSG(5IU/只)，其中5只在注射PMSG 48h時處死；其余15只在予PMSG 48h后再腹腔內(nèi)注射HCG(5IU/只)，分別于注射HCG后6、12和36h時處死。然后迅速取出雙側卵巢，固定后石蠟包埋，連續(xù)切片。分別采用免疫組織化學和原位雜交法檢測小鼠

3、不同發(fā)育階段的卵泡內(nèi)PARP-1，PARP-2蛋白和mRNA的表達水平。 第二部分 將雌性C57BL/6小鼠按月齡分為4月齡，9月齡和12月齡三組，每組7只。通過每天陰道涂片，HE染色觀察小鼠的動情周期變化，至少連續(xù)2個動情周期后進入實驗。4月齡和9月齡組于動情期，12月齡組于同期行頸椎脫臼法處死后快速取出雙側卵巢，固定后石蠟包埋，連續(xù)切片。分別采用免疫組織化學和原位雜交法檢測不同月齡小鼠卵巢內(nèi)PARP-1、PARP-2

4、蛋白和mRNA的表達水平，并用免疫組織化學法檢測不同月齡小鼠卵巢內(nèi)PAR的表達。 結果: 第一部分 1.1 PARP-1，PARP-2在小鼠不同發(fā)育階段卵泡中的表達 PARP-1、PARP-2在始基卵泡的顆粒細胞中均未見表達；在初級卵泡的顆粒細胞中開始呈陽性表達。PARP-1定位于顆粒細胞核，在竇前卵泡顆粒細胞中的表達逐漸增強(P<0.05)，在大竇前卵泡顆粒細胞中表達最強(p<0.05)；至早期竇卵泡及

5、其后階段，PARP-1表達逐漸減弱，至排卵前卵泡顆粒細胞中表達最弱，與竇前卵泡中的表達相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PARP-2主要定位于顆粒細胞漿，在竇前及竇狀卵泡的顆粒細胞中的表達逐漸增強(P<0.05)，至排卵前 卵泡顆粒細胞中的表達最強(P<0.05)。在卵母細胞中，細胞核和細胞漿均可見PARP-1表達。PARP-1高表達于始基卵泡卵母細胞核，隨后逐漸減弱(P<0.05)；而在始基卵泡卵母細胞漿中PARP-1

6、極淺著色，隨后與其在顆粒細胞中的表達趨勢一致。PARP-2主要表達于各級卵泡的卵母細胞漿。在始基卵泡著色較明顯，在初級卵泡中PARP-2表達較弱，而在竇前及竇狀卵泡中的表達又逐漸增強(P<0.05)，至排卵前卵泡卵母細胞漿中的表達最強。 此外，PARP-1/2分別在黃體顆粒細胞核和胞漿較強表達。PARP-1在卵泡膜細胞及卵巢間質(zhì)中均未見表達。PARP-2在卵泡膜細胞漿中極弱表達，在卵巢間質(zhì)細胞中亦未見表達。 1.2 PA

7、RP-1mRNA,PARP-2mRNA在不同發(fā)育階段卵泡中的表達 PARP-1/2 mRNA在不同發(fā)育階段的卵泡顆粒細胞中的表達較一致。兩者在初級卵泡的顆粒細胞漿中開始呈弱陽性表達，至竇前及竇狀卵泡階段，兩者在顆粒細胞漿中的表達均逐漸增強(P<0.05)。 PARP-1/2 mRNA在始基卵泡卵母細胞漿中呈弱陽性表達，并隨卵泡發(fā)育表達逐漸增強(P<0.05)，在排卵前卵泡中表達最強。 此外，PARP-1/2 mR

8、NA在黃體顆粒細胞漿中均較強表達。前者在卵泡膜細胞及間質(zhì)中較弱表達；后者弱表達于卵泡膜，而在間質(zhì)細胞中有較強表達。 第二部分 2.1 PARP-1，PARP-2在不同月齡小鼠各發(fā)育階段卵泡的表達 PARP-1在9月齡和12月齡小鼠的始基、初級和次級卵泡卵母細胞核中的表達明顯低于4月齡組(P<0.05)，在竇卵泡卵母細胞核中，PARP-1在9月齡鼠的表達低于4月齡鼠(P<0.05)，而在12月齡組的表達明顯高于4月

9、齡和9月齡組(P<0.05)；在各月齡組成熟竇卵泡的卵母細胞核中均未見PARP-1表達。在各級卵泡的卵母細胞漿中，PARP-1在三組的表達均隨月齡明顯下降(P<0.05)。在小鼠的始基、初級和次級卵泡卵母細胞中，PARP-2在9月齡鼠的表達明顯低于4月齡鼠(P<0.05)；而在竇卵泡和成熟竇卵泡卵母細胞中，PARP-2在兩組中的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在各級卵泡的卵母細胞中，PARP-2在12月齡鼠的表達均低于4月齡和9月齡組

10、(P<0.05)。 從初級至成熟竇卵泡各階段，PARP-1/2在9月齡，12月齡鼠卵泡的顆粒細胞中的表達均較4月齡組減弱(P<0.05)。 2.2 PARP-1、PARP-2mRNA在不同月齡小鼠各發(fā)育階段卵泡的表達 在卵泡發(fā)育的各階段，PARP-1/2mRNA在4月齡、9月齡、12月齡小鼠卵泡的卵母細胞及顆粒細胞中的表達均隨月齡下降(P<0.05)。 2.3 PAR在不同月齡小鼠不同發(fā)育階段卵泡的表達

11、 在各月齡組小鼠，PAR在始基卵泡中均未見表達。在初級卵泡的顆粒細胞漿中開始呈弱陽性表達，并隨卵泡的發(fā)育表達逐漸增強(P<0.05)，在成熟竇卵泡中的表達最強。并且在各級卵泡的顆粒細胞中，PAR在三組中的表達均隨月齡明顯下降(P<0.05)； 在4月齡及9月齡鼠中，PAR在次級卵泡卵母細胞漿中開始呈陽性表達，并隨卵泡的發(fā)育表達逐漸增強(P<0.05)，從次級至成熟竇卵泡階段的卵母細胞，PAR在9月齡組中的表達均較4月齡組明

12、顯減弱(P<0.05)；在12月齡組中，各級卵泡的卵母細胞中均未見PAR表達。 此外，PAR在卵泡液中有較強表達，在卵泡膜細胞中極弱表達，在卵巢間質(zhì)中未見表達。 結論: 1、本研究首次發(fā)現(xiàn)PARP-1、PARP-2在小鼠卵巢內(nèi)有表達；并且隨著小鼠卵泡的發(fā)育，PARP-1、PARP-2在各級卵泡卵母細胞和顆粒細胞的細胞核及細胞漿中的表達隨之變化； 2.PARP-1、PARP-2在老齡小鼠原始卵泡和早期生長卵