聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶在不同月齡小鼠卵巢上的表達(dá).pdf

1、本研究分為兩部分：1、對(duì)性成熟前雌性c57BL/6小鼠給予外源性促性腺激素，誘導(dǎo)其卵泡發(fā)育成熟。檢測(cè)PARP-1和PARP-2在小鼠各級(jí)卵泡中蛋白及mRNA的表達(dá)；初步探討PARP在小鼠卵巢中的定位及其在不同發(fā)育階段卵泡的表達(dá)程度，為進(jìn)一步闡明PARP在卵泡發(fā)育成熟中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；2、檢測(cè)不同月齡雌性c57BL/6小鼠卵巢內(nèi)PARP-1和PARP-2在蛋白及mRNA水平的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)PAR的表達(dá)；初步探討PARP及其活性與卵巢功

2、能老化的關(guān)系。 材料與方法: 第一部分 將25只3周齡性未成熟的C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為5組，每組5只。5只直接以頸椎脫臼法處死；余下20只予腹腔內(nèi)注射PMSG(5IU/只)，其中5只在注射PMSG 48h時(shí)處死；其余15只在予PMSG 48h后再腹腔內(nèi)注射HCG(5IU/只)，分別于注射HCG后6、12和36h時(shí)處死。然后迅速取出雙側(cè)卵巢，固定后石蠟包埋，連續(xù)切片。分別采用免疫組織化學(xué)和原位雜交法檢測(cè)小鼠

3、不同發(fā)育階段的卵泡內(nèi)PARP-1，PARP-2蛋白和mRNA的表達(dá)水平。 第二部分 將雌性C57BL/6小鼠按月齡分為4月齡，9月齡和12月齡三組，每組7只。通過每天陰道涂片，HE染色觀察小鼠的動(dòng)情周期變化，至少連續(xù)2個(gè)動(dòng)情周期后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。4月齡和9月齡組于動(dòng)情期，12月齡組于同期行頸椎脫臼法處死后快速取出雙側(cè)卵巢，固定后石蠟包埋，連續(xù)切片。分別采用免疫組織化學(xué)和原位雜交法檢測(cè)不同月齡小鼠卵巢內(nèi)PARP-1、PARP-2

4、蛋白和mRNA的表達(dá)水平，并用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同月齡小鼠卵巢內(nèi)PAR的表達(dá)。 結(jié)果: 第一部分 1.1 PARP-1，PARP-2在小鼠不同發(fā)育階段卵泡中的表達(dá) PARP-1、PARP-2在始基卵泡的顆粒細(xì)胞中均未見表達(dá)；在初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中開始呈陽性表達(dá)。PARP-1定位于顆粒細(xì)胞核，在竇前卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，在大竇前卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)(p<0.05)；至早期竇卵泡及

5、其后階段，PARP-1表達(dá)逐漸減弱，至排卵前卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)最弱，與竇前卵泡中的表達(dá)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PARP-2主要定位于顆粒細(xì)胞漿，在竇前及竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，至排卵前 卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)最強(qiáng)(P<0.05)。在卵母細(xì)胞中，細(xì)胞核和細(xì)胞漿均可見PARP-1表達(dá)。PARP-1高表達(dá)于始基卵泡卵母細(xì)胞核，隨后逐漸減弱(P<0.05)；而在始基卵泡卵母細(xì)胞漿中PARP-1

6、極淺著色，隨后與其在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)一致。PARP-2主要表達(dá)于各級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞漿。在始基卵泡著色較明顯，在初級(jí)卵泡中PARP-2表達(dá)較弱，而在竇前及竇狀卵泡中的表達(dá)又逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，至排卵前卵泡卵母細(xì)胞漿中的表達(dá)最強(qiáng)。 此外，PARP-1/2分別在黃體顆粒細(xì)胞核和胞漿較強(qiáng)表達(dá)。PARP-1在卵泡膜細(xì)胞及卵巢間質(zhì)中均未見表達(dá)。PARP-2在卵泡膜細(xì)胞漿中極弱表達(dá)，在卵巢間質(zhì)細(xì)胞中亦未見表達(dá)。 1.2 PA

7、RP-1mRNA,PARP-2mRNA在不同發(fā)育階段卵泡中的表達(dá) PARP-1/2 mRNA在不同發(fā)育階段的卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)較一致。兩者在初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞漿中開始呈弱陽性表達(dá)，至竇前及竇狀卵泡階段，兩者在顆粒細(xì)胞漿中的表達(dá)均逐漸增強(qiáng)(P<0.05)。 PARP-1/2 mRNA在始基卵泡卵母細(xì)胞漿中呈弱陽性表達(dá)，并隨卵泡發(fā)育表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，在排卵前卵泡中表達(dá)最強(qiáng)。 此外，PARP-1/2 mR

8、NA在黃體顆粒細(xì)胞漿中均較強(qiáng)表達(dá)。前者在卵泡膜細(xì)胞及間質(zhì)中較弱表達(dá)；后者弱表達(dá)于卵泡膜，而在間質(zhì)細(xì)胞中有較強(qiáng)表達(dá)。 第二部分 2.1 PARP-1，PARP-2在不同月齡小鼠各發(fā)育階段卵泡的表達(dá) PARP-1在9月齡和12月齡小鼠的始基、初級(jí)和次級(jí)卵泡卵母細(xì)胞核中的表達(dá)明顯低于4月齡組(P<0.05)，在竇卵泡卵母細(xì)胞核中，PARP-1在9月齡鼠的表達(dá)低于4月齡鼠(P<0.05)，而在12月齡組的表達(dá)明顯高于4月

9、齡和9月齡組(P<0.05)；在各月齡組成熟竇卵泡的卵母細(xì)胞核中均未見PARP-1表達(dá)。在各級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞漿中，PARP-1在三組的表達(dá)均隨月齡明顯下降(P<0.05)。在小鼠的始基、初級(jí)和次級(jí)卵泡卵母細(xì)胞中，PARP-2在9月齡鼠的表達(dá)明顯低于4月齡鼠(P<0.05)；而在竇卵泡和成熟竇卵泡卵母細(xì)胞中，PARP-2在兩組中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在各級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中，PARP-2在12月齡鼠的表達(dá)均低于4月齡和9月齡組

10、(P<0.05)。 從初級(jí)至成熟竇卵泡各階段，PARP-1/2在9月齡，12月齡鼠卵泡的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)均較4月齡組減弱(P<0.05)。 2.2 PARP-1、PARP-2mRNA在不同月齡小鼠各發(fā)育階段卵泡的表達(dá) 在卵泡發(fā)育的各階段，PARP-1/2mRNA在4月齡、9月齡、12月齡小鼠卵泡的卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中的表達(dá)均隨月齡下降(P<0.05)。 2.3 PAR在不同月齡小鼠不同發(fā)育階段卵泡的表達(dá)

11、 在各月齡組小鼠，PAR在始基卵泡中均未見表達(dá)。在初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞漿中開始呈弱陽性表達(dá)，并隨卵泡的發(fā)育表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，在成熟竇卵泡中的表達(dá)最強(qiáng)。并且在各級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中，PAR在三組中的表達(dá)均隨月齡明顯下降(P<0.05)； 在4月齡及9月齡鼠中，PAR在次級(jí)卵泡卵母細(xì)胞漿中開始呈陽性表達(dá)，并隨卵泡的發(fā)育表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，從次級(jí)至成熟竇卵泡階段的卵母細(xì)胞，PAR在9月齡組中的表達(dá)均較4月齡組明

12、顯減弱(P<0.05)；在12月齡組中，各級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中均未見PAR表達(dá)。 此外，PAR在卵泡液中有較強(qiáng)表達(dá)，在卵泡膜細(xì)胞中極弱表達(dá)，在卵巢間質(zhì)中未見表達(dá)。 結(jié)論: 1、本研究首次發(fā)現(xiàn)PARP-1、PARP-2在小鼠卵巢內(nèi)有表達(dá)；并且隨著小鼠卵泡的發(fā)育，PARP-1、PARP-2在各級(jí)卵泡卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞漿中的表達(dá)隨之變化； 2.PARP-1、PARP-2在老齡小鼠原始卵泡和早期生長卵