水菖蒲內(nèi)生菌的分離及其抑菌活性的研究.pdf

1、水菖蒲(Acorus calamus Linn.)作為一種傳統(tǒng)的民間藥，長期生長在污泥這種特殊的環(huán)境中，國內(nèi)外文獻研究表明具有很好的抑菌殺蟲活性。
　　 植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生大量新的天然產(chǎn)物，有些內(nèi)生菌還可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的代謝產(chǎn)物，已成為天然產(chǎn)物潛在的重要資源。本研究對水菖蒲內(nèi)生菌進行了分離，得到113株內(nèi)生菌，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌對其抗菌活性進行篩選，研究了菌株S9，S15，S24和S70的抗菌活性。發(fā)現(xiàn)

2、S9具有廣譜的抑菌活性，對其進行了抑菌活性物質(zhì)與菌株鑒定、生理條件與穩(wěn)定性，培養(yǎng)基條件的優(yōu)化以及水菖蒲抑菌活性的相關研究。本研究旨在探索從水菖蒲內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)抑菌活性成分的可能性，為研究新的天然產(chǎn)物抑菌藥物提供思路。主要研究內(nèi)容如下：
　　 (1)采用75％乙醇、次氯酸鈉溶液浸泡和無菌水洗滌、培養(yǎng)、分離的方法從水菖蒲內(nèi)分離內(nèi)生菌。研究表明：應同時設置超凈工作臺無菌狀態(tài)檢測對照、漂洗液檢測對照和組織印跡檢測對照等3種對照處理，確保內(nèi)

3、生菌分離準確性。水菖蒲體內(nèi)存在內(nèi)生菌且種類繁多、十分豐富，共分離到113株內(nèi)生菌，根莖、葉中均有分布，葉中的內(nèi)生菌數(shù)量明顯少于莖中。
　　 (2)用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和稻瘟霉作為初篩指示菌，分別代表了G+，G-菌，真菌，對分離得到的113株水菖蒲內(nèi)生菌進行了抗菌活性初篩，有50株菌對稻瘟霉P-2b具有抑制作用，46株對大腸桿菌或金黃色葡萄球菌有抗菌活性的菌株，分別占所有菌株的44.2％和40.7％，表明水菖蒲中有豐富的有抑

4、菌活性的內(nèi)生菌資源。對抑菌效果最強的四株菌-S9、S15、S24、S70，進行了進一步的抗菌能力研究。結(jié)果表明，S9對多種指示菌都有很好的抑制和殺滅效果。
　　 (3)研究了活性菌株S9發(fā)酵1-14天的生長特性，并檢測了生物量，pH值，殘?zhí)橇亢蛯χ甘揪淖钚∫志鷿舛?。結(jié)果顯示發(fā)酵液在1-3天進入對數(shù)增長期，第4-6d為穩(wěn)定期，從第7d開始進入衰亡期，在整個過程中，生物量、pH、發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢鸵志钚宰兓@著。
　　

5、(4)研究了S9發(fā)酵液對溫度、光照、pH值和傳代等的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，發(fā)酵液對溫度、光照有較好的穩(wěn)定性，1-7代內(nèi)菌株抑菌活性無明顯改變。但pH值對發(fā)酵液的活性影響較大，在偏酸的環(huán)境下，活性較好，在堿性環(huán)境下無活性。并初步研究了S9發(fā)酵液的活性部位，結(jié)果表明S9發(fā)酵液的活性成分存在于胞外產(chǎn)物，胞內(nèi)物質(zhì)基本無抑菌活性；同時，發(fā)酵液中的多糖蛋白等大分子物質(zhì)無抑菌活性。
　　 (5)通過單因素試驗，Plackett-Burman試驗和

6、響應面法對水菖蒲內(nèi)生菌S9的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明水菖蒲內(nèi)生菌S9的最佳發(fā)酵條件為溫度28℃，蔗糖用量26 g·L-1，pH值為6.7，培養(yǎng)基裝液量50mL，轉(zhuǎn)速140 r/min，KH2PO4為1mmol/L，馬鈴薯加入量為250 g·L-1，酵母膏的含量20 g·L-1。
　　 (6)采用五部分離法，研究了水菖蒲內(nèi)生菌S9發(fā)酵產(chǎn)物各極性部位的抑菌活性，初步判定其最強的抑菌活性部位為石油醚相，對各種細菌、絲狀真菌和酵母菌

7、均有不同程度的抑制作用，對各種指示細菌的最小抑菌濃度(MIC)為15-30μg·mL-1，對指示細菌的最小殺菌濃度為30-60μg·mL-1；對四種酵母樣真菌的最小抑菌濃度為12.5-50μg·mL-1；對六種絲狀真菌的最小抑菌活性為15-500μg·mL-1。并通過形態(tài)鑒定和ITS序列分析，鑒定水菖蒲內(nèi)生菌S9為木霉屬，其與Hypocrea lixii sp.屬中的各菌株具有極高的同源性高達98％。通過GC-MS分析，結(jié)果表明其石油醚