水菖蒲內(nèi)生菌的分離及其抑菌活性的研究.pdf

1、水菖蒲(Acorus calamus Linn.)作為一種傳統(tǒng)的民間藥，長(zhǎng)期生長(zhǎng)在污泥這種特殊的環(huán)境中，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)研究表明具有很好的抑菌殺蟲(chóng)活性。
　　 植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生大量新的天然產(chǎn)物，有些內(nèi)生菌還可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的代謝產(chǎn)物，已成為天然產(chǎn)物潛在的重要資源。本研究對(duì)水菖蒲內(nèi)生菌進(jìn)行了分離，得到113株內(nèi)生菌，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌對(duì)其抗菌活性進(jìn)行篩選，研究了菌株S9，S15，S24和S70的抗菌活性。發(fā)現(xiàn)

2、S9具有廣譜的抑菌活性，對(duì)其進(jìn)行了抑菌活性物質(zhì)與菌株鑒定、生理?xiàng)l件與穩(wěn)定性，培養(yǎng)基條件的優(yōu)化以及水菖蒲抑菌活性的相關(guān)研究。本研究旨在探索從水菖蒲內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)抑菌活性成分的可能性，為研究新的天然產(chǎn)物抑菌藥物提供思路。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 (1)采用75％乙醇、次氯酸鈉溶液浸泡和無(wú)菌水洗滌、培養(yǎng)、分離的方法從水菖蒲內(nèi)分離內(nèi)生菌。研究表明：應(yīng)同時(shí)設(shè)置超凈工作臺(tái)無(wú)菌狀態(tài)檢測(cè)對(duì)照、漂洗液檢測(cè)對(duì)照和組織印跡檢測(cè)對(duì)照等3種對(duì)照處理，確保內(nèi)

3、生菌分離準(zhǔn)確性。水菖蒲體內(nèi)存在內(nèi)生菌且種類(lèi)繁多、十分豐富，共分離到113株內(nèi)生菌，根莖、葉中均有分布，葉中的內(nèi)生菌數(shù)量明顯少于莖中。
　　 (2)用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和稻瘟霉作為初篩指示菌，分別代表了G+，G-菌，真菌，對(duì)分離得到的113株水菖蒲內(nèi)生菌進(jìn)行了抗菌活性初篩，有50株菌對(duì)稻瘟霉P-2b具有抑制作用，46株對(duì)大腸桿菌或金黃色葡萄球菌有抗菌活性的菌株，分別占所有菌株的44.2％和40.7％，表明水菖蒲中有豐富的有抑

4、菌活性的內(nèi)生菌資源。對(duì)抑菌效果最強(qiáng)的四株菌-S9、S15、S24、S70，進(jìn)行了進(jìn)一步的抗菌能力研究。結(jié)果表明，S9對(duì)多種指示菌都有很好的抑制和殺滅效果。
　　 (3)研究了活性菌株S9發(fā)酵1-14天的生長(zhǎng)特性，并檢測(cè)了生物量，pH值，殘?zhí)橇亢蛯?duì)指示菌的最小抑菌濃度。結(jié)果顯示發(fā)酵液在1-3天進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，第4-6d為穩(wěn)定期，從第7d開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，在整個(gè)過(guò)程中，生物量、pH、發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢鸵志钚宰兓@著。
　　

5、(4)研究了S9發(fā)酵液對(duì)溫度、光照、pH值和傳代等的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，發(fā)酵液對(duì)溫度、光照有較好的穩(wěn)定性，1-7代內(nèi)菌株抑菌活性無(wú)明顯改變。但pH值對(duì)發(fā)酵液的活性影響較大，在偏酸的環(huán)境下，活性較好，在堿性環(huán)境下無(wú)活性。并初步研究了S9發(fā)酵液的活性部位，結(jié)果表明S9發(fā)酵液的活性成分存在于胞外產(chǎn)物，胞內(nèi)物質(zhì)基本無(wú)抑菌活性；同時(shí)，發(fā)酵液中的多糖蛋白等大分子物質(zhì)無(wú)抑菌活性。
　　 (5)通過(guò)單因素試驗(yàn)，Plackett-Burman試驗(yàn)和

6、響應(yīng)面法對(duì)水菖蒲內(nèi)生菌S9的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明水菖蒲內(nèi)生菌S9的最佳發(fā)酵條件為溫度28℃，蔗糖用量26 g·L-1，pH值為6.7，培養(yǎng)基裝液量50mL，轉(zhuǎn)速140 r/min，KH2PO4為1mmol/L，馬鈴薯加入量為250 g·L-1，酵母膏的含量20 g·L-1。
　　 (6)采用五部分離法，研究了水菖蒲內(nèi)生菌S9發(fā)酵產(chǎn)物各極性部位的抑菌活性，初步判定其最強(qiáng)的抑菌活性部位為石油醚相，對(duì)各種細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌

7、均有不同程度的抑制作用，對(duì)各種指示細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)為15-30μg·mL-1，對(duì)指示細(xì)菌的最小殺菌濃度為30-60μg·mL-1；對(duì)四種酵母樣真菌的最小抑菌濃度為12.5-50μg·mL-1；對(duì)六種絲狀真菌的最小抑菌活性為15-500μg·mL-1。并通過(guò)形態(tài)鑒定和ITS序列分析，鑒定水菖蒲內(nèi)生菌S9為木霉屬，其與Hypocrea lixii sp.屬中的各菌株具有極高的同源性高達(dá)98％。通過(guò)GC-MS分析，結(jié)果表明其石油醚