孕馬尿雌酮硫酸鈉單抗研制及其檢測(cè)試紙條制備方法研究.pdf

1、目的：研制雌酮硫酸鈉單克隆抗體，研究建立檢測(cè)孕馬尿中雌酮硫酸鈉的簡(jiǎn)單，快速，方便的膠體金免疫層析試紙條的方法，為馬產(chǎn)業(yè)后續(xù)的工作提供所收集的每一批尿液中結(jié)合雌激素的初步檢測(cè)含量。
　　方法：1.選擇12只6～8周齡的BALB/c雌性小鼠進(jìn)行免疫，研究了免疫方式、免疫劑量及免疫次數(shù)對(duì)免疫效價(jià)的影響。2.選擇6只BALB/c雌性小鼠，以200/100μg/只，免疫四次。用ELISA法篩選血清效價(jià)高，高抗體敏感性的小鼠。3.在50％聚乙

2、二醇1450(PEG)的作用下，將高效價(jià)小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合(脾細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞=10:1)并接種于24 h前準(zhǔn)備的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)板中，HAT培養(yǎng)液對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，用 ELISA法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選、鑒定。4.采用辛酸-飽和硫酸銨法粗純化腹水結(jié)合蛋白A親和層析法純化腹水，測(cè)定腹水抗體。5.采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液。用所制膠體金溶液標(biāo)記抗ESS單克隆抗體，建立膠體金免疫層析快速檢測(cè)孕馬尿中ESS的方法，并通

3、過(guò)檢測(cè)孕馬尿中雌酮硫酸鈉來(lái)確證它的特異性和靈敏度。
　　結(jié)果：1.融合率達(dá)90.2%，ELISA篩選陽(yáng)性率為4.4%，并篩得兩株特異性和敏感性均較好的細(xì)胞株2C8和8A7擴(kuò)大培養(yǎng)后制備腹水單抗。純化后的腹水單抗2C8和8A7蛋白濃度分別為3.12mg/mL，3.57mg/mL。經(jīng)ELISA法檢測(cè)得2C8，8A7的腹水效價(jià)分別為1:1.02×105，1:2.05×105。競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)2C8和8A7兩株腹水單抗的IC50值為12

4、.5ng/mL。8A7單抗與ESS結(jié)構(gòu)相似的雌激素進(jìn)行交叉反應(yīng)性檢測(cè)，與馬烯雌酮硫酸鈉有一定的交叉反應(yīng)，與其他雌激素?zé)o交叉反應(yīng)。2.所制備膠體金溶液的膠體金粒徑大小紫外掃描后計(jì)算判定是19.76nm；最適抗體標(biāo)記量為8μg/mL，最佳標(biāo)記pH為8.2。質(zhì)控線羊抗小鼠IgG包被濃度為2mg/mL，每條1.5μL；檢測(cè)線ESS-Mab的包被濃度為0.5mg/mL，每條1.5μL；檢測(cè)ESS標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度為50ng/mL；特異性比多克隆抗體膠體