小鵝瘟病毒快速檢測試紙條的研制及應(yīng)用.pdf

1、小鵝瘟(Gosling Plague，GP)是由鵝細小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起的雛鵝或雛番鴨的一種傳播快、死亡率高、高度接觸性急性或亞急性敗血性傳染病;主要侵害4-20日齡雛鵝和雛番鴨;以腸道栓塞為其特征性病變，是嚴重危害養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一。瓊脂擴散試驗是檢測GPV的傳統(tǒng)方法，此方法操作簡單、方便、快速且經(jīng)濟，適宜在基層推廣和應(yīng)用，但是靈敏度較低，對抗原抗體的要求比較高。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速

2、發(fā)展，小鵝瘟的診斷技術(shù)也隨之取得了一些進展，建立的方法主要包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和核酸探針技術(shù)。這些方法具有敏感性高、特異好等優(yōu)點，但是也存在著一些局限性，例如需要特殊的儀器，高昂的經(jīng)濟代價等。本研究擬建立一種簡單、方便、直觀快速的膠體金檢測方法來解決生產(chǎn)實踐中所遇到的臨床檢測GPV的技術(shù)問題。
　　1.膠體金的制備及粒徑的選擇
　　本部分研究通過檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法分別制備了粒徑分別為15nm、30nm和40n

3、m的膠體金，并且分別摸索出其標記的最佳pH為7.44、7.61、8.66，最佳蛋白量為7.7μg/mL、8.8μg/mL、8.8μg/mL，成功制備了膠體金-抗體復(fù)合物。通過目測比較，透射電鏡鑒定，最終篩選出pH7.61最佳蛋白量8.8μg/mL30nm的膠體金為最佳粒徑并應(yīng)用于本研宄試紙條的制備。
　　2.膠體金試紙條性能的研究
　　通過對膠體金試紙條的膠體金-抗體復(fù)合物的最佳噴量、金標墊的處理、NC膜T線和C線處理、封閉

4、液的選擇等工藝指標進行摸索并優(yōu)化。最終確定最佳噴量1∶1稀釋，30μL/cm、用含0.1％Tween-20，0.3％BSA，4％蔗糖的PB溶液處理玻璃纖維素膜、NC膜T線C線2.0mg/mL的抗體，0.7μL/cm、封閉液為1％B SA封閉兩個小時。特異性實驗結(jié)果顯示本研究制備的試紙條只與GPV反應(yīng)，而與常見家禽H9亞型禽流感病毒(AIV-H9)、馬立克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)和雞貧血病病毒(CAV)等沒有交叉反應(yīng)，具有

5、良好的特異性;試紙條的檢測靈敏度用小鵝瘟病毒尿囊液完成。用病毒滴度為3.3×104.1LD50/ml的尿囊液作為檢測原時，本試紙條可以檢測到約80個LD50;試紙條批內(nèi)、批間重復(fù)性良好，同時將其抽真空并置于4℃保存六個月時，其靈敏度、特異性等性能無明顯變化。
　　3.試紙條的臨床應(yīng)用
　　收集臨床疑似發(fā)病的雛鵝，天鵝，櫻桃谷鴨的病料，初步應(yīng)用本研究制備的試紙條進行GPV抗原檢測，并與病毒分離的方法進行同步對比實驗。實驗結(jié)果表