雌酮硫酸鈉多克隆抗體的制備與免疫分析法的研究.pdf

1、目的：利用抗原和抗體的特異性結合反應對微量抗原或抗體進行測定的方法，研究制備雌酮硫酸鈉（Sodium estrone sulfate,ESS）多克隆抗體(polyclonal antibody,PcAb)及建立簡單快速、靈敏、經(jīng)濟的膠體金免疫層析試紙條和酶聯(lián)免疫試劑盒分析雌酮硫酸鈉的方法。方法：（1）以雌酮硫酸鈉和牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)為主要原料，將ESS進行結構修飾，經(jīng)各種譜圖鑒定確證結構后，再

2、用混合酸酐法制備完全抗原，并以紫外掃描和凝膠電泳法分析完全抗原的偶聯(lián)比率，運用合成的免疫原（Hapten-BSA,Hap-BSA）免疫家兔，采集血清，純化獲得雌酮硫酸鈉多克隆抗體。（2）用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備的適宜粒徑的膠體金進行多克隆抗體標記，膠體金標記抗體經(jīng)純化后，噴涂于玻璃纖維膜上制成膠體金結合墊。將雌酮硫酸鈉的多克隆抗體(檢測線)和羊抗兔IgG(質(zhì)控線)分別噴涂在硝酸纖維素（Nitrocellulose ,NC)膜上。干燥后

3、依次將NC膜、膠金結合墊、樣品墊、吸水墊粘貼在膠板上，使用切刀切成3mm×5.5cm的試紙條，并通過檢測孕馬尿中雌酮硫酸鈉來確證它的特異性和靈敏度。(3)用過碘酸鈉改良法制備辣根過氧化物酶-雌酮硫酸鈉多克隆抗體蛋白結合物（Horseradish peroidase conjugated anti-ESS IgG, HRP-anti-ESS-IG），方陣滴定法確定包被最適工作濃度及HRP-anti-ESS-IgG最適稀釋倍數(shù)后，用雙抗夾心

4、法制備用于檢測孕馬尿中雌酮硫酸鈉的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。結果：（1）衍生后產(chǎn)物經(jīng)各種譜圖鑒定為雌酮硫酸鈉-17-肟。半抗原衍生物與載體蛋白BSA成功偶聯(lián)，其偶聯(lián)比為25.74。采用間接ELISA測定產(chǎn)生的抗血清稀釋度可以達到 1.28×105；經(jīng)親和層析法純化后蛋白濃度為3.179mg/mL。（2）采用檸檬酸三鈉法還原法制備膠體金，金顆粒直徑在10~20nm之間，滿足試紙條的要求，經(jīng)比較試驗選用Millipore公司產(chǎn)品型號為HF135的

5、硝酸纖維膜作為層析試紙條材料；質(zhì)控線羊抗兔 IgG包被濃度為2 mg/mL，每條1.5μl；檢測線ESS-Pacb的包被濃度為1.6mg/mL，每條1.5μl；樣品墊、結合墊均采用 Millipore 公司的專用材料。檢測ESS標準品靈敏度為30ng /mL。（3）雙抗夾心ELISA的檢測程序為：用濃度為40μg/mL抗體蛋白包被酶標板，包被液為CB，包被條件為 4℃包被過夜；封閉液為1%牛血清白蛋白，封閉條件為室溫（23℃~25℃）孵