結(jié)締組織生長因子單克隆抗體超微超順磁氧化鐵納米粒子的制備及生物活性研究.pdf

1、研究目的：通過分子探針成像顯示標(biāo)記的靶目標(biāo)，是目前分子成像的主要機制，而制備特異靶向性的分子探針是活體分子成像的關(guān)鍵因素。超順磁性氧化鐵(superparmagneticiron oxide，SPIO)納米分子探針因其良好的生物相容性及磁共振(MRI)信號敏感性而成為研究熱點。本研究通過化學(xué)修飾合成方法制備結(jié)締組織生長因子(connective tissuegrowth factor,CTGF)單克隆抗體超微超順磁氧化鐵(ultrasm

2、all superparamagnetic ironoxide，USPIO)粒子分子探針，檢測其免疫活性、穩(wěn)定性及細(xì)胞毒性，同時進行體外細(xì)胞水平特異靶向性試驗，為該分子探針在體成像打下基礎(chǔ)，進而為動態(tài)研究纖維化相關(guān)病理過程和心血管疾病發(fā)生機制提供新方法。
　　 研究方法：1.采用二巰基丁二酸(meso-2,3-dimercaptosuccinic acid，DMSA)修飾的化學(xué)共沉淀法制備DMSA包被γ-三氧化二鐵納米粒子(γ-

3、Fe2O3)，并通過乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride，EDC)化學(xué)連接劑，將抗CTGF單克隆抗體與DMSA包被的超順磁氧化鐵納米顆粒以生成化學(xué)共價鍵的形式相結(jié)合，形成具有免疫活性的分子探針，通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及Western blotting方法檢測其免疫活性及生物穩(wěn)定性。2.采用體外人臍靜脈內(nèi)皮

4、細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，運用MTT法及臺盼藍(lán)活細(xì)胞計數(shù)法檢測該分子探針的細(xì)胞毒性；用含30mmol/L葡萄糖的1640培養(yǎng)液干預(yù)2天后，將合成的分子探針與干預(yù)細(xì)胞共孵育后通過鐵染色、磁共振成像及透射電鏡等方法進行體外水平細(xì)胞特異靶向性檢測。
　　 結(jié)果：1.應(yīng)用EDC法制備成CTGF單克隆抗體超微超順磁氧化鐵粒子，ELISA方法所得的吸光度值(OD)有隨加入抗體含量增多而增高的趨勢，與未結(jié)合抗體的USPIO組相比較差異顯著(P＜0.0

5、5)，在間隔30d和60d后再次測量，只有200μg單抗組OD值有所下降，特別是0d與30d相比差異顯著(P＜0.05)，其余組未見明顯變化。Westernblotting試驗中，結(jié)合單抗的USPIO及單純單抗均顯示出條帶，而BSA-USPIO對照組則未顯示條帶。2.通過臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞計數(shù)，MTT法測得吸光度(OD)值并進行毒性評級。結(jié)果顯示，各不同濃度的標(biāo)記單抗USPIO組與陽性對照組(聚丙烯酰胺單體)比較均有顯著差異(P＜0.05

6、)，而與陰性對照組(1640培養(yǎng)液)比較均無顯著差異(P＞0.05)，同時該合成材料毒性評級為0-1級，屬于無細(xì)胞毒性范疇。普魯士藍(lán)染色可見，只含血清1640培養(yǎng)液的單純細(xì)胞組，基本無藍(lán)色鐵顆粒出現(xiàn)。標(biāo)記有CTGF單抗鐵粒子組與BSA-USPIO組及標(biāo)記非特異性單抗鐵粒子組相比，于細(xì)胞內(nèi)外明顯可見大量的藍(lán)染鐵顆粒。通過7.0T微型磁共振掃描儀掃描結(jié)果示，標(biāo)記CTGF單抗鐵粒子組、BSA-USPIO組、標(biāo)記非特異性單抗鐵粒子組與單純細(xì)胞組

7、的T2弛豫時間比較呈不同程度降低(P＜0.05)，同時，標(biāo)記CTGF單抗鐵粒子組與BSA-USPIO組、標(biāo)記非特異性單抗鐵粒子組的T2弛豫時間相比明顯減少，(P＜0.05)，且T2加權(quán)圖像的信號強度也顯著降低。通過透射電鏡技術(shù)(TEM)觀察CTGF單抗氧化鐵納米粒子及BSA-USPIO與細(xì)胞共孵育后，前者在細(xì)胞內(nèi)及表面均可見到電子致密物沉積，后者在細(xì)胞溶酶體內(nèi)未見或見到少量電子致密物沉積，其胞內(nèi)分布明顯少于前者。
　　 結(jié)論：1