抗人胰島素樣生長因子-1單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、目的：胰島素樣生長因子－1(insulin－like growth factor-1，IGF-1)診斷試劑盒目前在國際上只有美國、德國等幾個國家生產，且價格及其昂貴，導致在國內臨床上的應用大大受限。本實驗室曾選用多種載體制備IGF-1蛋白抗原，但效果不理想，蛋白得率均比較低，給進一步制備IGF-1單克隆抗體及生產IGF-1診斷試劑盒帶來困難。為填補國內IGF-1診斷試劑盒自主生產的空白，本實驗室在既往實驗研究的基礎上，選用pET29a(

2、+)、pET32a(+)載體，表達并純化含有hIGF-1的重組蛋白，從而制備穩(wěn)定分泌抗hIGF-1單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的雜交瘤細胞系，并對其分泌的mAb進行鑒定。 方法：1.采用PCR法，擴增編碼hIGF－1前體cDNA的片段，通過雙酶切、膠回收純化、連接后得到pET29a(+)/hIGF-1、pET32a(+)/hIGF-1重組載體。2.分別將其轉化入工程菌BL21(DE3)中，經(jīng)異丙基

3、－β－D－硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導后表達的重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化。3.用免疫印跡(Westernblot)法檢測重組蛋白的抗原活性。4.用純化后的hIGF-1重組蛋白免疫Balb/c小鼠，利用雜交瘤細胞融合技術制備抗hIGF-1的mAb。5.對mAb進行鑒定，包括用Western blot法鑒定mAb的特異性，用間接酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunos