結(jié)締組織生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合肽的篩選及其生物活性的研究.pdf

1、目的：纖維化是多種慢性病的常見(jiàn)病理過(guò)程之一。作為多個(gè)信號(hào)通路中的下游作用因子，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)在纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，因此CTGF是一個(gè)更具特異性的靶點(diǎn)。對(duì)于細(xì)胞因子拮抗劑的研究是目前纖維化疾病治療中的熱點(diǎn)。本研究試圖從隨機(jī)十二肽庫(kù)中篩選與CTGF特異性結(jié)合的噬菌體克隆，利用基因工程技術(shù)獲得與CTGF特異性結(jié)合的小肽，初步研究該小肽是否能抑制CTGF促

2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移的活性。為開(kāi)發(fā)CTGF小分子抑制劑打下基礎(chǔ)，進(jìn)而為纖維化疾病的治療提供新途徑。 方法：1.用基因重組方法制備硫氧化還原蛋白(TrxA)及硫氧化還原蛋白-結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(TrxA-CTGF)融合蛋白；噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)經(jīng)TrxA預(yù)吸附后，與TrxA-CTGF結(jié)合，逐步增加選擇壓力，經(jīng)過(guò)4輪親和篩選后隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆，提取單鏈DNA后進(jìn)行測(cè)序；用直接噬菌體-ELISA試驗(yàn)檢測(cè)噬菌體剛性克隆與CTGF

3、結(jié)合的特異性。2.設(shè)計(jì)并合成一段帶有腸激酶切割位點(diǎn)的基因片段，插入pET-32(a)+質(zhì)粒載體中硫氧化還原蛋白基因下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coliBL21表達(dá)菌中，用終濃度1mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白；用熱變性和硫酸銨分級(jí)沉淀對(duì)融合蛋白進(jìn)行初步純化，用親和層析進(jìn)一步純化，經(jīng)腸激酶切割后用凝膠過(guò)濾層析分離獲得目的小肽；用反相色譜對(duì)所獲小肽進(jìn)行純度鑒定。3.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，采利用MTT試驗(yàn)觀察所獲小肽是否能抑制

4、CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用、利用Transwell試驗(yàn)觀察所獲小肽是否能抑制CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。 結(jié)果：1.10個(gè)噬菌體陽(yáng)性克隆中8個(gè)DNA序列完全一致，命名為810A，另有2個(gè)序列各不相同，分別命名為810B、810C；根據(jù)三聯(lián)密碼子推導(dǎo)810A、810B、810C的氨基酸序列分別為L(zhǎng)LADXXXXRPWT、HATGXXXXSLSH、TSGYXXXXGRWR；計(jì)算其相對(duì)分子量分別為1448.627D

5、、1218.315D、1502.725D，等電點(diǎn)分別為7.985、8.075、12.185；陽(yáng)性噬菌體克隆810A用直接噬菌體-ELISA試驗(yàn)證實(shí)能與CTGF發(fā)生特異性結(jié)合，與TrxA及陰性對(duì)照比較差異顯著(P<0.05)。2.所構(gòu)建的重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致；誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE鑒定，發(fā)現(xiàn)在相對(duì)分子量20000D處有濃密的表達(dá)條帶出現(xiàn)，與預(yù)期分子量一致；融合蛋白用熱變性、硫酸銨分級(jí)沉淀、親和層析、腸激酶切割、凝膠過(guò)濾層析

6、分離獲得目的小肽，用反相色譜鑒定其純度大于95％；最終每升發(fā)酵液獲得3.4mg目的肽。3.0.1μg·mL-1CTGF能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，與陰性對(duì)照比較差異顯著(P<0.05)，濃度為10μg·mL-1的小肽810A能抑制0.1μg·mL-1CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，與陽(yáng)性對(duì)照比較差異顯著(P<0.05)，而濃度分別為2μg·mL-1、0.4μg·mL-1、0.08μg·mL-1、0.016μg·mL-1、0.003

7、2μg·mL-1、0.00064μg·mL-1的小肽810A不能抑制0.1μg·mL-1CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，與陽(yáng)性對(duì)照比較無(wú)顯著差異(P>0.05)：1μg·mL-1CTGF可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移，與陰性對(duì)照相比有顯著差異(p<0.05)，濃度分別為1mg·mL-1、100μg·mL-1、10μg·mL-1、1μg·mL-1、0.1μg·mL-1的小肽810A能抑制1μg·mL-1CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作