芽孢桿菌的生防菌株篩選及其抑病機(jī)理.pdf

1、本研究從感染根結(jié)線蟲的番茄根系中分離到46個(gè)細(xì)菌菌株，NA平板初篩獲得13個(gè)抑制青枯雷爾氏菌生長(zhǎng)的拮抗菌株，其抑菌圈寬度達(dá)7.1～26.3 mm，同時(shí)測(cè)得其中12個(gè)菌株對(duì)多種植物病原真菌有不同程度的抑制作用。溫室試驗(yàn)表明，菌株EN5、EN15、EN01和EN16對(duì)青枯病的抑病效果最為顯著，平均防效分別為70.82％、89.54％、85.38％和78.81％；而EN5、SW1和SB2能有效降低番茄根結(jié)線蟲病的根結(jié)指數(shù)，抑病效果均達(dá)49％。

2、同時(shí)測(cè)定了這些菌株對(duì)青枯病菌-根結(jié)線蟲復(fù)合病的防治效果，結(jié)果表明，EN5、SW1和SB2能顯著降低復(fù)合病害的病情指數(shù)，其中SW1的防效最佳，青枯病指數(shù)比對(duì)照下降56.66，根結(jié)指數(shù)降低5.21。自然土中重復(fù)測(cè)定EN5等7個(gè)菌株對(duì)青枯病和復(fù)合病害的抑病作用，其中菌株EN5、EN16、SW1和SB1的抑病效果較為穩(wěn)定。通過形態(tài)和生理生化特征初步鑒定，菌株EN5、EN15、EN01、SB1、SB2和SW1等6個(gè)菌株為枯草芽孢桿菌(Bacill

3、us subtilis)，而EN16為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)；16S rDNA序列分析進(jìn)一步確定菌株EN5為枯草芽孢桿菌內(nèi)生亞種(V.subtilis subsp.endophvticus)。 對(duì)菌株EN5、EN16、SW1和SB1防治番茄青枯病的作用機(jī)理進(jìn)行分析，結(jié)果表明，菌株EN5處理番茄后20d，在番茄根莖部有較高定殖量(達(dá)3.60×10<'4>cfu/g·FW)，該菌株胞外液無抗菌活性，其抑病效

4、果僅13.56％，菌體抑病效果則高達(dá)71.19％，因此推斷其作用機(jī)理是以菌體的定殖競(jìng)爭(zhēng)作用為主；菌株SBl胞外液的抗菌活性相當(dāng)顯著，其抑病效果達(dá)50.85％，而定殖力明顯弱于其他三個(gè)供試菌株，誘導(dǎo)試驗(yàn)中防效較差，由此推測(cè)其抑病作用主要依賴于胞外液的抗菌活性；SW1和EN16胞外液的抑病效果分別為22.03％和27.12％，遠(yuǎn)低于其菌體的抑病作用，同時(shí)兩菌株具有較好的定殖力，說明抑病作用與其菌體的定殖力有關(guān)，此外，誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)表明兩菌株能

5、有效地誘導(dǎo)番茄抗青枯病，誘發(fā)過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等抗病相關(guān)性酶活性的顯著增強(qiáng)，因此，誘導(dǎo)抗性是它們的主要抑病機(jī)制之一。 以電鏡觀察法進(jìn)一步分析菌株EN5在番茄根莖組織中的分布，結(jié)果顯示，EN5主要分布于主根基部及莖部的韌皮組織、細(xì)胞間隙等部位。盆栽試驗(yàn)分析EN5菌株在不同土壤條件、不同接種方式及不同作物中的定殖力，結(jié)果表明，菌株EN5在自然土和滅菌土條件下均能穩(wěn)定地定殖于番茄植株；

6、浸種、浸根和灌根處理?xiàng)l件下，以灌根法的定殖效果最佳；在番茄、煙草和黃瓜體內(nèi)均可定殖，其中在番茄和煙草體內(nèi)的定殖量較大。菌株EN5對(duì)番茄體內(nèi)及土壤中微生物種群影響的測(cè)定結(jié)果表明，EN5處理后，植株內(nèi)3類主要微生物種群數(shù)量明顯減少，而土壤中微生物種群在處理初期有所減少，處理后期則多數(shù)微生物群體，尤其是氨化細(xì)菌、固氮菌等生理微生物群體數(shù)量顯著增多，此外，ERIC-PCR結(jié)果也表明，EN5的處理還對(duì)根圍土中微生物的種類產(chǎn)生一定的影響。菌株EN1

7、6和SW1灌根處理后2～10 d內(nèi)挑戰(zhàn)接種青枯病菌，均能有效誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯病的抗性，其中以間隔期為7～10d誘導(dǎo)效果最好，與此結(jié)果相符的是，POD、PPO和PAL的酶活力在7～10d時(shí)也達(dá)到較高值。以灌根和浸種法接種菌株EN16和SW1，灌根處理可有效誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生抗病性，浸種處理誘導(dǎo)效果較差。盆試測(cè)定菌株SW1和EN16對(duì)煙草花葉病毒病的誘導(dǎo)效果，結(jié)果表明，菌株SW1的誘導(dǎo)效果優(yōu)于菌株EN16；病程相關(guān)蛋白結(jié)果進(jìn)一步說明菌株SW1可以誘

8、導(dǎo)煙草葉片中多種PR蛋白的大量積累，其誘導(dǎo)蛋白譜與乙酰水楊酸的有較大一致性，而EN16誘導(dǎo)后PR蛋白積累量較小，與乙酰水楊酸的不完全相同。 誘變?cè)囼?yàn)表明，菌株SB1的抑病作用與其胞外液的活性呈正相關(guān)性。為了提高胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)量，對(duì)多種培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，葡萄糖和礦物質(zhì)可以促進(jìn)活性物質(zhì)的分泌。對(duì)抗菌物質(zhì)理化性質(zhì)的分析表明，SB1分泌的抗菌物質(zhì)對(duì)熱穩(wěn)定、對(duì)紫外線和蛋白酶有較好的耐受力，具有水溶性和脂溶性特點(diǎn)。采用柱層析和高效

9、液相技術(shù)，分離并鑒定了PD培養(yǎng)上清液中的抗菌成分為表面活性素，PCR技術(shù)檢測(cè)SBl菌株中的抗菌素基因，結(jié)果表明，SB1菌株中的表面活性素合成基因srfA與報(bào)道序列(BACSRFAB)同源性達(dá)98％，菌株中伊枯草菌素合成基因ituB與報(bào)道的伊枯草菌素A的序列(AB050629)同源性達(dá)97.2％。進(jìn)一步用電鏡觀察、紫外光譜掃描和SDS-PAGE分析SB1菌株抗菌成分對(duì)青枯病菌的拮抗機(jī)理，結(jié)果顯示，處理后細(xì)菌胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞裂解，DNA呈現(xiàn)明

10、顯的增色效應(yīng)，同時(shí)胞內(nèi)和胞外蛋白質(zhì)的表達(dá)量均受到了影響。 以含有抗菌素基因的質(zhì)粒為模板，PCR合成表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和抗菌蛋白TasA的地高辛標(biāo)記探針，采用斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)24個(gè)菌株的相關(guān)基因加以檢測(cè)，并用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法分析陽性樣品中表面活性素基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，以陽性質(zhì)粒為模板，獲得1200 bp、1479 bp和790 bp的3個(gè)特異性探針，其檢測(cè)靈敏度分別為2、20和0.1