尿道下裂發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、尿道下裂（Hypospadias）是小兒最常見(jiàn)的泌尿生殖道先天畸形。由于陰莖及前尿道發(fā)育不全，尿道開(kāi)口異常伴陰莖下彎畸形，導(dǎo)致患兒不能站立排尿，并影響成年后性功能及生育力。手術(shù)矯正畸形是本病的唯一治療措施，但術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率較高，是患兒及家長(zhǎng)的心患。為此，有關(guān)尿道下裂病因的研究受到學(xué)者們關(guān)注，以期通過(guò)尿道下裂病因?qū)W的研究尋找其預(yù)防、治療學(xué)突破。 尿道下裂發(fā)病率約1/200～1/300，而且有逐年增加趨勢(shì)，大量研究提示其發(fā)病率的增

2、加與環(huán)境雌激素污染密切相關(guān)。鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）是一種廣泛應(yīng)用于塑料及化工產(chǎn)業(yè)的增塑劑，在醫(yī)療工作和日常生活中被大量應(yīng)用，已構(gòu)成我國(guó)嚴(yán)重的“白色污染”。DEHP進(jìn)入環(huán)境后不易被降解，能蓄積于人體產(chǎn)生雌激素樣生物活性。課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)DEHP可損害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物睪丸及附睪功能導(dǎo)致小鼠隱睪畸形，可同時(shí)伴有尿道下裂的產(chǎn)生。雖有文獻(xiàn)報(bào)道DEHP能誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尿道下裂，但是未就其機(jī)制深入研究。因此，本課題針對(duì)DEHP對(duì)外生殖器

3、的毒性損傷，研究其致畸機(jī)制，為進(jìn)一步防治尿道下裂發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。 目的：利用DEHP的外生殖器的毒性損傷，誘導(dǎo)胎鼠尿道下裂；體內(nèi)外觀察陰莖發(fā)育情況，檢測(cè)細(xì)胞凋亡改變、TGF-β1及ATF3等在陰莖組織中的表達(dá)；對(duì)比尿道下裂患者與正常兒童包皮TGF-β1表達(dá)差異，深入探討尿道下裂發(fā)生機(jī)制。 方法：1.將C57BL/6及KM孕鼠分為對(duì)照組與DEHP處理組，DEHP處理組分為100mg/kg·d、200mg/kg·d與500

4、mg/kg·d三個(gè)劑量組（DEHP100，DEHP200，DEHP500），于妊娠12.5d～17.5d（GD12.5～17.5）期間灌胃；對(duì)照組于同期用0.1mL玉米油灌胃。于GD19剖腹取出胎鼠，對(duì)比觀察胎鼠陰莖與尿道發(fā)育；尿道橡膠管型重塑胎鼠尿路情況，測(cè)量尿道長(zhǎng)度；統(tǒng)計(jì)尿道下裂發(fā)生率。采用整體原位雜交（WISH）技術(shù)檢測(cè)胎鼠陰莖中TGF-β1 mRNA的表達(dá)。 2.獲取上述各組胎鼠及幼年鼠陰莖，運(yùn)用免疫熒光、RT-PCR、

5、western blot技術(shù)檢測(cè)TGF-β1與ATF3的表達(dá)；經(jīng)TUNEL染色觀察陰莖內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白：Bcl-2、Bax及P53的表達(dá)。 3.取正常GD12.5胎鼠陰莖體外培養(yǎng)，分別經(jīng)不同劑量的MEHP、TGF-β1細(xì)胞因子及MEHP+TGF-β1單克隆抗體干預(yù)，觀察陰莖發(fā)育情況，運(yùn)用RT-PCR對(duì)比TGF-β1與ATF3基因表達(dá)的變化。 4.取尿道下裂病人與正常兒童包皮，采用免疫組化、RT-PCR及熒

6、光實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)TGF-β1表達(dá)，對(duì)比其差異。 結(jié)果：1.DEHP成功誘導(dǎo)出尿道下裂小鼠動(dòng)物模型，尿道下裂表現(xiàn)為陰莖體變短、尿道開(kāi)口異位、包皮分裂，DEHP100、DEHP200與DEHP500尿道下裂發(fā)生率分別為7.1％、14.0％和75.7％；實(shí)驗(yàn)組雄性胎鼠體重及肛門(mén)尿道口距離（AGD）均值隨DEHP劑量增加而逐漸減?。╬<0.05）；尿道橡膠管型顯示尿道下裂胎鼠尿道變短，尤以前尿道明顯，中高劑量組尿道長(zhǎng)度較對(duì)照組明顯縮

7、短（p<0.001）；陰莖連續(xù)切片顯示實(shí)驗(yàn)組尿道軸偏向陰莖腹側(cè)，尿道板向腹側(cè)隆起及融合過(guò)程落后。WISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胎鼠陰莖中TGF-β1 mRNA特異表達(dá)于尿道板及尿道上皮。 2.RT-PCR、免疫熒光及western blot均顯示在胎鼠陰莖內(nèi)，TGF-β1與ATF3 mRNA與蛋白的表達(dá)隨DEHP劑量的增加而逐漸增強(qiáng)，而在生后20d及40d小鼠陰莖內(nèi)，TGF-β1 mRNA的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照；陰莖細(xì)胞的凋亡減少伴P53表達(dá)

8、下降，而B(niǎo)cl-2/Bax比值無(wú)明顯變化。 3.體外培養(yǎng)條件下胎鼠陰莖能夠較好生長(zhǎng)，MEHP及TGF-β1細(xì)胞因子能顯著抑制陰莖發(fā)育。MEHP不能上調(diào)TGF-β1及ATF3 mRNA的表達(dá)，TGF-β1細(xì)胞因子也不能上調(diào)ATF3 mRNA的表達(dá)，TGF-β1抗體不能抑制ATF3 mRNA的表達(dá)。 4.尿道下裂患兒包皮中TGF-β1表達(dá)具有低于正常兒童趨勢(shì)。 結(jié)論：DEHP誘導(dǎo)胎鼠尿道下裂可能與其上調(diào)TGF-β1及