尿道下裂差異表達miRNA的篩選研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過篩選尿道下裂包皮組織中差異表達的miRNA，探討miRNA及其靶基因和信號通路在尿道下裂的發(fā)病機制中的作用，尋找尿道下裂預防和治療的新靶點。
　　方法：
　　收集9例尿道下裂患兒及3例包莖患兒的包皮組織作為研究對象，其中3例尿道下裂患兒術前接受過HCG治療。分別在組織中抽提總RNA，對總RNA進行質量檢測，利用丹麥Exiqon公司研制的芯片篩選差異性表達的miRNA，同時采用RT-PCR方法對芯片

2、結果進行驗證。進一步結合生物信息學方法對 miRNA的靶基因進行預測，并應用DAVID數(shù)據(jù)庫進行靶基因功能富集分析和信號轉導通路富集分析。探討總結與尿道下裂發(fā)病、治療和預后相關的miRNA及其調控機制。
　　結果
　　1. miRNA芯片技術篩選結果：選擇差異倍數(shù)兩倍以上、P值<0.05的差異表達miRNA進行聚類分析。與包莖患兒比較，尿道下裂患兒包皮組織中表達上調的miRNA共19個，表達下調的miRNA共15個。對尿道下

3、裂患兒術前是否應用HCG治療也做了對比分析，術前應用藥物較未應用藥物患兒包皮組織中表達上調的miRNA共25個，表達下調的miRNA共19個。進一步對所有包皮組織差異表達miRNA進行綜合分析發(fā)現(xiàn)部分miRNA形成在尿道下裂組低表達，而在包莖和尿道下裂術前應用藥物治療組高表達。
　　2. RT-PCR驗證結果：選擇差異表達的10個miRNA進行RT-PCR驗證，其中5個miRNA得到驗證，其差異表達趨勢與芯片結果相符，分別為let

4、-7b-3p、miR-145-5p、miR-376a-3p、miR-377-3p、miR-1-3p。
　　3.生物信息學結果：let-7b-3p、miR-145-5p、miR-376a-3p、miR-377-3p、miR-1-3p可能與尿道下裂發(fā)病相關，靶基因為SOX9、FGF14、FGFR2、TCF7L2、ZEB2、PAX3、SOD1、ZFPM2、THBS1、PAX6、SMAD4、DMRT2等，其功能與胚胎發(fā)育、腺體發(fā)育、性別分

5、化和傷口愈合等相關，相關信號通路為MAPK信號通路、TGFβ信號通路、Wnt信號通路、鈣信號轉導通路和前列腺癌相關信號通路等。
　　結論
　　1.首次建立尿道下裂miRNA基因表達譜，篩選出差異表達的miRNA，在尿道下裂與包莖、術前是否用藥物治療的尿道下裂間獲得差異表達 miRNA，并推測miRNA表達趨勢。
　　2.通過構建特異性莖環(huán)RT引物，采用實時定量PCR技術，驗證了10個差異表達miRNA，其中5個miRN