低濃度膠原酶差速消化法分離純化小鼠Leydig細胞的實驗研究.pdf

1、目的：國內(nèi)外常用percoll 連續(xù)梯度密度或非連續(xù)梯度密度離心及離心淘洗等方法分離純化Leydig細胞，雖可獲得高達90％的初始純度，但培養(yǎng)困難，原代培養(yǎng)即出現(xiàn)顯著的細胞凋亡。本研究利用Leydig 細胞在發(fā)育過程中逐漸向睪丸間質中央巢狀聚集的特性，并保留與Leydig 細胞關系極為密切的前體細胞，建立簡單快速獲得Leydig 細胞的分離純化新方法。
　　 方法：應用0.03％的低濃度膠原酶NB4，分別以150rpm 高速振蕩

2、消化15min、130rpm 柔和消化15min，130rpm 再次消化15min，將獲得的細胞在同等條件下進行原代培養(yǎng)，對比三次獲取的Leydig 細胞初始純度，原代擴增速度，原代擴增后純度，并通過免疫熒光鑒定其Leydig 細胞內(nèi)的標志性酶----3β羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）、膽固醇側鏈裂解酶（CYP11A1）和17α羥化酶（CYP17A1）的表達情況。
　　 結果：使用低濃度膠原酶在不同轉速下短時間重復三次消化，以

3、第二次消化獲得的細胞量最大，Leydig 細胞純度最高（69.6％±4.16％），增殖能力最強。培養(yǎng)7天后純度增高至90％。原代培養(yǎng)的各個階段均可檢測到睪酮合成酶譜的表達。
　　 結論：應用低濃度膠原酶差速消化法，保留第二階段消化所獲細胞進行培養(yǎng)，可獲得初始純度約70％的Leydig 細胞，其原代培養(yǎng)效果理想，細胞功能保存完好，原代培養(yǎng)表達睪酮合成酶譜，具備合成睪酮的客觀條件，且培養(yǎng)后純度可增高至90％。較傳統(tǒng)的Leydig 細