睪丸Leydig干細(xì)胞分離、純化及鑒定的體外研究.pdf

1、睪丸Leydig干細(xì)胞分離、純化及鑒定的體外研究
　　 研究背景
　　 Leydig細(xì)胞(LCs)是男性體內(nèi)睪酮的主要來(lái)源，Leydig細(xì)胞發(fā)育異常，功能不全或數(shù)量異常，在青春期將影響男性第二性征的形成，在性成熟期會(huì)出現(xiàn)雄激素缺乏性疾病，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)成分改變，肌肉力量和軀體功能下降，性功能、生殖功能降低，情緒低落以及認(rèn)知能力的減退[1]。引起該類(lèi)疾病的病因也趨向多樣化，如因創(chuàng)傷、腫瘤等造成的睪丸缺失，先天性疾病，環(huán)境污染

2、，工作壓力日益加劇和人口老齡化等原因，使得近年來(lái)雄激素缺乏性疾病的發(fā)病率具有逐年上升的趨勢(shì)[2, 3]。針對(duì)這類(lèi)疾病，目前尚無(wú)滿意的治療措施，最常用的治療方法是補(bǔ)充外源性雄激素，但其臨床應(yīng)用較為困難，補(bǔ)充的量及時(shí)間難以掌握，無(wú)法符合機(jī)體的生物節(jié)律，且長(zhǎng)期應(yīng)用后存在較多的并發(fā)癥[1,4]。
　　 隨著組織工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，以組織工程技術(shù)構(gòu)建雄激素分泌組織，有望成為一種理想的治療手段[5-7]。本課題組前期研究證實(shí)了Leydig細(xì)

3、胞構(gòu)建雄性激素分泌組織的可行性，但研究發(fā)現(xiàn)成熟LCs不能增殖，存活時(shí)間短，構(gòu)建組織無(wú)法長(zhǎng)期維持功能[8, 9]。同其它功能分化細(xì)胞一樣，睪丸Leydig細(xì)胞也來(lái)源于原始未分化的Leydig干細(xì)胞，睪丸內(nèi)Leydig細(xì)胞通過(guò)Leydig干細(xì)胞（Leydig Stem Cells，SLCs）的增殖、分化維持群體數(shù)目的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定[10, 11]。由于Leydig干細(xì)胞具有雄性激素分泌潛能和自我更新能力，而且有可能在植入后受到機(jī)體先天調(diào)控機(jī)制的影

4、響，從而更符合生理要求，因此成為最有前景的雄激素分泌組織構(gòu)建的種子細(xì)胞。長(zhǎng)期以來(lái)SLCs由于缺乏特異性的標(biāo)志物而阻礙了其分離及純化。此外，由于睪丸內(nèi)細(xì)胞成分較多，且存在復(fù)雜的細(xì)胞通信，研究證實(shí)通過(guò)各種方法所獲得的含SLCs的Leydig細(xì)胞群，其中的干細(xì)胞很快就發(fā)生分化，難以維持干性，因而無(wú)法獲得大量SLCs。近年來(lái)，SLCs得到確認(rèn)及鑒定并有分離純化的報(bào)道[12]，但由于采用傳統(tǒng)的Percoll分離法及免疫粘附法，SLCs的流失量及損

5、傷較大，難以滿足做為組織工程種子細(xì)胞的需求，此外SLCs在體外的培養(yǎng)特性，培養(yǎng)方法，增殖能力，干性維持能力及睪酮分泌能力均缺乏詳細(xì)的研究。研究目的
　　 本研究擬通過(guò)膠原酶消化、差速貼壁法及雙抗體免疫磁珠分選法，改進(jìn)Leydig干細(xì)胞的分離及純化方法。由7天大鼠睪丸內(nèi)獲取純化的Leydig干細(xì)胞，進(jìn)一步研究在體外條件下SLCs的培養(yǎng)特性，包括在條件培養(yǎng)液中的增殖能力及干性維持能力。通過(guò)對(duì)表面標(biāo)志物及產(chǎn)生睪酮關(guān)鍵酶的測(cè)定，并經(jīng)定向

6、誘導(dǎo)分Leydig細(xì)胞系鑒定Leydig干細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)分化后Leydig細(xì)胞的睪酮分泌能力，從而初步解決組織工程化雄激素分泌組織研究中種子細(xì)胞的問(wèn)題。
　　 研究方法
　　 一.
　　 差速貼壁法分離大鼠Leydig細(xì)胞群：獲取生后7天齡雄性Wistar大鼠雙側(cè)睪丸，4℃無(wú)菌條件下去除白膜及較大的血管，用膠原酶震蕩消化和400目（Ф33μm）不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，離心后貼壁培養(yǎng)2小時(shí)，然后棄上清并漂洗1次，獲得Ley

7、dig細(xì)胞群。
　　 二
　　 ． 雙抗體免疫磁珠分選法獲取純化的SLCs：將貼壁分離法獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù)、離心，然后重新懸浮，4℃條件下加入LHR抗體孵育30分鐘后，離心去除上清后懸浮細(xì)胞，加入免疫磁珠放置15分鐘，上機(jī)經(jīng)自動(dòng)磁性活化細(xì)胞分選(MACS)獲取陰選細(xì)胞。所獲得的陰選細(xì)胞重復(fù)上述步驟，加入PDGFRα抗體和免疫磁珠分別孵育30分鐘及15分鐘，再次經(jīng)MACS獲取陽(yáng)選細(xì)胞，由此得到純化的PDGFRα(+)/LHR(

8、-)細(xì)胞。
　　 三.
　　 條件培養(yǎng)體系對(duì)SLCs增殖及干性維持作用：純化的細(xì)胞獲取后以條件培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)改變及培養(yǎng)特性，采用CCK(Cell Counting Kit)法測(cè)定其增殖能力并繪制增殖曲線。對(duì)培養(yǎng)一個(gè)月后的細(xì)胞進(jìn)行3β-HSD免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析，觀察其干性維持能力。
　　 四.
　　 SLCs表面標(biāo)志物及酶的檢測(cè)：對(duì)Lyedig細(xì)胞系細(xì)胞標(biāo)志物PDGFRα，干細(xì)胞

9、標(biāo)志物L(fēng)IFR， Leydig細(xì)胞分化的特異性酶3β-HSD進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析以鑒定SLCs。
　　 五
　　 ． SLCs的誘導(dǎo)分化及睪酮分泌潛能的檢測(cè)：將SLCs分兩組按照1.0×105/ well密度接種于24孔板上，其中一組在條件培養(yǎng)液中加入T3， HCG對(duì)SLCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，隔日收集誘導(dǎo)分化組和未誘導(dǎo)組培養(yǎng)液上清，經(jīng) Access 全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)（RIA，放射免疫測(cè)定）測(cè)定睪酮水平，觀察其

10、分化能力及睪酮分泌潛能。
　　 研究結(jié)果研究目的
　　 本研究擬通過(guò)膠原酶消化、差速貼壁法及雙抗體免疫磁珠分選法，改進(jìn)Leydig干細(xì)胞的分離及純化方法。由7天大鼠睪丸內(nèi)獲取純化的Leydig干細(xì)胞，進(jìn)一步研究在體外條件下SLCs的培養(yǎng)特性，包括在條件培養(yǎng)液中的增殖能力及干性維持能力。通過(guò)對(duì)表面標(biāo)志物及產(chǎn)生睪酮關(guān)鍵酶的測(cè)定，并經(jīng)定向誘導(dǎo)分Leydig細(xì)胞系鑒定Leydig干細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)分化后Leydig細(xì)胞的睪酮分泌能

11、力，從而初步解決組織工程化雄激素分泌組織研究中種子細(xì)胞的問(wèn)題。
　　 研究方法
　　 一.
　　 差速貼壁法分離大鼠Leydig細(xì)胞群：獲取生后7天齡雄性Wistar大鼠雙側(cè)睪丸，4℃無(wú)菌條件下去除白膜及較大的血管，用膠原酶震蕩消化和400目（Ф33μm）不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，離心后貼壁培養(yǎng)2小時(shí)，然后棄上清并漂洗1次，獲得Leydig細(xì)胞群。
　　 二
　　 ． 雙抗體免疫磁珠分選法獲取純化的SLCs

12、：將貼壁分離法獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù)、離心，然后重新懸浮，4℃條件下加入LHR抗體孵育30分鐘后，離心去除上清后懸浮細(xì)胞，加入免疫磁珠放置15分鐘，上機(jī)經(jīng)自動(dòng)磁性活化細(xì)胞分選(MACS)獲取陰選細(xì)胞。所獲得的陰選細(xì)胞重復(fù)上述步驟，加入PDGFRα抗體和免疫磁珠分別孵育30分鐘及15分鐘，再次經(jīng)MACS獲取陽(yáng)選細(xì)胞，由此得到純化的PDGFRα(+)/LHR(-)細(xì)胞。
　　 三.
　　 條件培養(yǎng)體系對(duì)SLCs增殖及干性維持作用：純

13、化的細(xì)胞獲取后以條件培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)改變及培養(yǎng)特性，采用CCK(Cell Counting Kit)法測(cè)定其增殖能力并繪制增殖曲線。對(duì)培養(yǎng)一個(gè)月后的細(xì)胞進(jìn)行3β-HSD免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析，觀察其干性維持能力。
　　 四.
　　 SLCs表面標(biāo)志物及酶的檢測(cè)：對(duì)Lyedig細(xì)胞系細(xì)胞標(biāo)志物PDGFRα，干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)IFR， Leydig細(xì)胞分化的特異性酶3β-HSD進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞

14、分析以鑒定SLCs。
　　 五
　　 ． SLCs的誘導(dǎo)分化及睪酮分泌潛能的檢測(cè)：將SLCs分兩組按照1.0×105/ well密度接種于24孔板上，其中一組在條件培養(yǎng)液中加入T3， HCG對(duì)SLCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，隔日收集誘導(dǎo)分化組和未誘導(dǎo)組培養(yǎng)液上清，經(jīng) Access 全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)（RIA，放射免疫測(cè)定）測(cè)定睪酮水平，觀察其分化能力及睪酮分泌潛能。
　　 研究結(jié)論
　　 本研究證實(shí)由差速貼壁法及雙

15、抗體免疫磁珠分選法能獲得純化的PDGFRα(+)/LHR(-)陰性細(xì)胞，該細(xì)胞能夠在條件培養(yǎng)液中增殖，并在體外培養(yǎng)一個(gè)月后維持未分化狀態(tài)，此外，經(jīng)各種標(biāo)志物檢測(cè)證實(shí)Leydig細(xì)胞標(biāo)志物PDGFRα(+)，干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)IFR(+)，Leydig細(xì)胞分化的特異性酶3β-HSD為陰性，經(jīng)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞具有睪酮分泌能力并表現(xiàn)為3β-HSD(+)。由此證實(shí)細(xì)胞符合SLCs所必需具有的特征：1、在體外能自我更新 2、能維持未分化狀態(tài) 3、具有向