磁珠結合質譜分析2型糖尿病腎病早期尿液多肽及藥物干預研究.pdf

1、糖尿病腎病(DiabeticNephropathy，DN)是2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)患者常見的、嚴重影響生活質量的慢性并發(fā)癥，發(fā)病率逐年升高，據(jù)估測[1]，2030年全世界T2DM患者數(shù)量將從2000年的1.71億增加到3.66億，其中30％-40％的T2DM將發(fā)展為DN，在歐美國家DN是終未期腎病(End-stagerenaldisease，ESRD)的最常見病因[2]，約占全部ESRD病例的

2、44％。早期診斷DN并干預其發(fā)展越來越受到醫(yī)學界的重視，但DN起病隱襲，早期缺乏明顯的臨床癥狀。目前臨床上早期診斷DN存在較大困難。腎活檢是早期診斷最可靠的方法，然而，很多患者不愿意接受這種具有創(chuàng)傷性的侵入檢查，很多接受檢查的患者腎臟組織病理活檢并不能找到特征性的病理改變[3]。腎穿刺活檢術不能作為T2DM患者檢查的常規(guī)項目。而尿液富含腎臟病變信息，取材簡單、無創(chuàng)傷，可重復取樣，目前被廣泛認可的糖尿病腎病的早期實驗室診斷標準是持續(xù)性微量

3、白蛋白尿，已有許多研究發(fā)現(xiàn)尿微量白蛋白(Microalbuminuria，MALB)作為DN早期診斷指標的準確性和特異性不高，2型糖尿病患者大多年齡較大，常伴有高血壓、冠心病等合并癥，微量白蛋白尿也可因這些并發(fā)癥引起[4]。且在MALB出現(xiàn)時，DN已發(fā)展到第Ⅲ期，因而只依靠監(jiān)測MALB并不能及時準確地對DN做出診斷，會帶來較高的誤診和漏診。因此2型糖尿病腎病的早期診斷迫切需要尋找新的特異性標志物以判斷病情，指導治療，評價療效。隨著蛋白質

4、組學技術的發(fā)展，將其與體液技術相結合的尿液蛋白質組學技術為DN早期診斷標志物的篩選提供了技術支持，利用尿液蛋白質組學技術可能發(fā)現(xiàn)一些新的DN早期診斷標志物并作為藥物療效評價的指標。本研究通過弱陽離子(weakcationexchange，WCX)磁珠分離系統(tǒng)聯(lián)合基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-flightMassSpectrometry

5、，MALDI-TOF-MS)技術對2型糖尿病患者及模型動物的尿液標本進行比較蛋白組學分析，并對模型動物進行干預研究。本課題研究內容共分為以下三部分。
　　 第一部分:2型糖尿病腎病患者尿小分子多肽差異分析;
　　 第二部分:2型糖尿病腎病大鼠模型的建立及腎病早期尿小分子多肽差異分析;
　　 第三部分:厄貝沙坦干預對糖尿病腎病大鼠尿小分子多肽影響。
　　 第一部分:2型糖尿病腎病患者尿小分子多肽差異分析

6、r>　　 目的:利用弱陽離子磁珠分離系統(tǒng)結合MALDI-TOF-MS的方法獲取糖尿病腎病患者的尿小分子多肽譜。
　　 方法:按Mogensen標準，68例2型糖尿病患者經測三天平均微量白蛋白尿排泄率(UrinaryAlbaminExcretionRate，UAER)后分組，其中正常蛋白尿(A)組24例，微量白蛋白(B)組22例，大量蛋白(C)組22例;健康對照(D)組20例。A及B組腎小球率過濾(glomerularfiltr

7、ationrate，GFR)均＞90ml/(min·1.73m2)，C組GFR60～89ml/(min·(1).73m2)。采用WCX磁珠純化試劑盒富集尿多肽，再經MALDI-TOF-MS技術，采集尿液多肽譜，應用ClinProtTM軟件進行生物學比較分析。
　　 結果:質荷比＜12000時，A組與D組相比，有15個蛋白質峰差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。B組與D組相比，有1個蛋白質峰差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0298）。C組

8、與D組相比，有10個蛋白質峰差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論:弱陽離子磁珠分離系統(tǒng)聯(lián)合MALDI-TOF-MS蛋白質檢測技術，能夠獲得健康人及DN患者尿液小分子多肽譜，為進一步從中尋找早期篩查及評價干預效果的標志物提供基礎。
　　 第二部分:2型糖尿病腎病大鼠模型的建立及腎病早期尿小分子多肽差異分析
　　 目的:探尋高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）誘導致2型糖尿病

9、大鼠糖尿病腎病早期尿液小分子差異多肽。
　　 方法:①40只4周齡SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機分為糖尿病模型(A)組30只和對照(B)組10只，A組應用高糖高脂飲食6周聯(lián)合STZ注射（以注射時計為0），誘導致2型糖尿病大鼠模型，B組正常飲食;②每2周測體質量，尾靜脈取血檢測血糖;-2、2、12周周末收集各組大鼠24小時尿液、血樣本和腎臟標本。尿液測24小時白蛋白排泄率，血樣本測胰島素、膽固醇、甘油三脂等指標，腎臟

10、標本HE染色光鏡下觀察。③將大鼠尿液分為四組:A1組（-2周末時A組尿液，10個標本）、A2組（12周末時A組尿液，10個標本）;B組（12周末時B組尿液，10個標本）。采用弱陽離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術對各組尿液樣本進行尿液多肽譜的采集，應用ClinProTools軟件進行生物學比較分析。
　　 結果:①高糖高脂飲食6周聯(lián)合25mg/kgSTZ腹腔注射誘導2型糖尿病腎病大鼠模型，成模率87％，成模大鼠具有高血糖、

11、高血脂、胰島素抵抗等特點，并出現(xiàn)DN相應的形態(tài)及功能改變。②弱陽離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術檢測三組尿液。ClinProTools軟件分析后發(fā)現(xiàn)A1和B組間無明顯差異。A2組和B組間多肽譜比較發(fā)現(xiàn)有7個差異多肽峰具有統(tǒng)計學意義，在A2組表達高表達有4個，低表達的有3個。
　　 結論:①利用高糖高脂飲食6周聯(lián)合小劑量STZ可以成功誘導2型糖尿病腎病大鼠模型。②弱陽離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術，能獲得2型糖尿

12、病大鼠糖尿病腎病早期和正常對照大鼠尿液多肽譜，并有效地鑒定出峰度較高的差異峰。
　　 第三部分:厄貝沙坦干預對糖尿病腎病大鼠尿小分子多肽影響
　　 目的：探討血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)1型受體拮抗劑(Angiotensinreceptorblocker，ARB)厄貝沙坦對2型糖尿病大鼠尿小分子多肽的影響。
　　 方法：①將30只實驗大鼠隨機分成正常對照組（A組）、糖尿病組（B組）、厄貝沙坦

13、治療組（C組）。高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ誘導致2型糖尿病大鼠糖尿病腎病早期，以STZ注射時計為0;②C組在造模成功后3天即開始喂服厄貝沙坦[50mg/(kg·d)，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司）]，B組則以等體積蒸餾水灌胃。每2周末測體質量、血壓，尾靜脈取血檢測血糖;-2、12周末收集各組大鼠24小時尿液、血樣本和腎臟標本。尿液測24小時白蛋白排泄率，血樣本測胰島素、膽固醇、甘油三脂等指標。腎臟標本測腎重后制作病理切片。③將大鼠

14、尿液分為四組:A1組（-2周時A組尿液，8個標本）、A2組(12周時A組尿液，8個標本)、B組（12周時B組尿液，8個標本）和C組（12周時C組尿液，8個標本）。采用弱陽離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術對各組尿液樣本進行尿液多肽譜的采集，應用ClinProTools軟件進行生物學比較分析。
　　 結果:①弱陽離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術檢測四組尿液。ClinProTools軟件分析后發(fā)現(xiàn)A1和A2組間無明顯差

15、異。A2組和B組間多肽譜比較發(fā)現(xiàn)有7個差異多肽峰具有統(tǒng)計學意義，在B組表達高表達有4個，低表達的有3個。C組和A2組間多肽譜比較發(fā)現(xiàn)有5個差異多肽峰具有統(tǒng)計學意義，在C組表達高表達有3個，低表達的有2個。C組和B組間多肽譜比較發(fā)現(xiàn)有2個差異多肽峰具有統(tǒng)計學意義，在C組表達高表達有1個，低表達的有1個。②C組12周時腎臟病理結構與同時期B組比較改變輕微。
　　 結論:①弱陽離子磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術，能獲得2型糖尿病