冬凌草甲素對小鼠急性肝損傷保護作用的研究及Keap1第四外顯子突變位點的篩查.pdf

1、背景：
　　 Nrf2/Keap1 信號通路對于細胞抵御外來有害氧化應(yīng)激刺激非常重要。Nrf2是細胞核轉(zhuǎn)錄因子，控制表達和協(xié)調(diào)誘導(dǎo)一系列編碼去毒酶和抗氧化蛋白的防御基因。在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)下，Nrf2 在胞漿中與其抑制因子Keap1 結(jié)合，處于功能抑制狀態(tài)。當(dāng)細胞受到氧化應(yīng)激刺激時，Nrf2 從Keap1中脫離并以穩(wěn)定狀態(tài)進入細胞核內(nèi)，與未知蛋白質(zhì)結(jié)合為異二聚體，并與ARE 即抗氧化反應(yīng)元件相結(jié)合促進其下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達，對細胞和組

2、織起到保護作用。我們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素不但可以啟動Nrf2 下游基因的轉(zhuǎn)錄，并對小鼠急性肝損傷有保護作用。
　　 正常情況下Keap1 可將Nrf2 帶入泛素通路而對其進行降解，當(dāng)Keap1 發(fā)生基因突變時將無法降解Nrf2，從而導(dǎo)致Nrf2 在細胞核內(nèi)的聚集。有研究表明，在肺癌、乳腺癌及膀胱癌中有因Keap1 突變使其功能的失活無法降解Nrf2，導(dǎo)致新陳代謝酶的活化及抗藥性的產(chǎn)生。越來越多的實驗證據(jù)表明在幾種腫瘤中因為先天的

3、或后天的機制使Nrf2 持續(xù)性激活，而使腫瘤得以生存及分化。最初的報道揭示在H1184和H1648 肺癌細胞系中Keap1的錯義突變導(dǎo)致抑制Nrf2 功能的喪失。隨后，在54例非小細胞肺癌中及12例細胞系中分別確定出10例和6例Keap1的錯義突變、插入和缺失。重要的是報道這些突變導(dǎo)致了Nrf2的持續(xù)激活。而且Keap1的突變經(jīng)常伴隨基因座的雜合缺失，說明在非小細胞肺癌中Keap1的等位基因的缺失很常見。后來更多的Keap1的突變被確定

4、，其中腺癌29例中有3例，大細胞癌2例中有1例，小細胞肺癌8例中有1例。
　　 有項研究表明在人Q293 乳腺癌細胞系中包含一個失活的Keap1蛋白。在膽道腫瘤病人中也發(fā)現(xiàn)有突變，13例膽囊癌病人中有4例發(fā)現(xiàn)有Keap1 突變。這些結(jié)果說明Keap1因突變導(dǎo)致的失活除了在肺癌中發(fā)生，也存在其他腫瘤中。我們通過對人食管癌Keap1第四外顯子的擴增及測序，發(fā)現(xiàn)一個同義突變位點。此同義突變位點可能對Keap1的功能沒有影響，但其他外顯

5、子中有無突變目前尚無報道。
　　 目的：驗證Nrf2/Keap1 信號通路對于急性肝損傷有至關(guān)重要的保護作用。并通過對食管癌Keap1 第四外顯子的突變位點的檢測，來證實Keap1基因突變是否存在于食管癌中。
　　 方法：
　　 將C57BL/6小鼠40 只隨機分為四組：對照組、低劑量冬凌草甲素組、中劑量冬凌草甲素組、大劑量冬凌草甲素組，構(gòu)建不同保護模型。通過經(jīng)胃給予對照組C57BL/6小鼠0.05ml PEG4

6、00、后三組給予灌注相同濃度（400μg/mL）不同劑量冬凌草甲素（分別為1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg）4周后，再共同灌注56 度紅星二鍋頭(0.1ml/10g)1周后處死取材，檢測小鼠肝功AST、ALT 水平是否有差異；并取小鼠肝臟行HE染色，光鏡下觀察肝臟病理變化，了解肝臟損傷情況。另外取36例人食管癌組織及癌旁組織提取基因組DNA，并以此為模板擴增Keap1 第4 外顯子。得到目的片段后，經(jīng)過純化后直接行序列測定并與

7、正常序列比對，查找基因突變位點。
　　 結(jié)果：
　　 冬凌草甲素能通過Nrf2/Keap1 信號通路，降低酒精對小鼠肝臟的損傷。人食管癌Keap1的第四外顯子中發(fā)現(xiàn)一個同義突變位點。
　　 結(jié)論：
　　 冬凌草甲素通過激活Nrf2 轉(zhuǎn)錄因子，減輕有害物質(zhì)如酒精對小鼠肝臟造成的急性損傷；食管癌Keap1的第四外顯子中發(fā)現(xiàn)一個同義突變位點，未能發(fā)現(xiàn)錯義突變，無法說明Nrf2/Keap1 通路的異常可能也存在于