萊克多巴胺及磺胺二甲基嘧啶免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、萊克多巴胺屬于β-受體激動(dòng)劑家族苯乙胺類成員之一，此類化合物因其具有促進(jìn)和提高動(dòng)物生長(zhǎng)效率而受關(guān)注，萊克多巴胺在增加豬日增重、提高胴體瘦肉率、增加飼料轉(zhuǎn)化、降低脂肪的積聚、縮短飼養(yǎng)周期等方面具有強(qiáng)大的功效。萊克多巴胺常被豬場(chǎng)作為飼料添加劑使用，萊克多巴胺的非法使用，導(dǎo)致了其在動(dòng)物體內(nèi)的蓄積性殘留，引發(fā)人體的急性食物中毒。因此，我國(guó)及歐盟各國(guó)政府禁止進(jìn)口含有Rac的肉品，并明確規(guī)定禁止使用Rac作為促生長(zhǎng)劑。為了控制和預(yù)防豬的某些疾病、促

2、進(jìn)豬的生長(zhǎng)，磺胺二甲基嘧啶常常被添加在豬的飼料之中，磺胺二甲基嘧啶在飼喂動(dòng)物的組織中具有蓄積作用，豬組織中磺胺二甲基嘧啶的殘留，對(duì)消費(fèi)者而言將是一種潛在的危害，可引起過敏反應(yīng)、干擾腸道菌群并誘生抗性菌群，從而導(dǎo)致抗生素的療效下降?；前范谆奏み€是一種可疑的致癌物，研究表明高濃度的磺胺二甲基嘧啶可以引起鼠的甲狀腺瘤。FDA規(guī)定了磺胺二甲基嘧啶的休藥期為15d，并設(shè)定了磺胺二甲基嘧啶在組織中的最高殘留限量為100ng/g。近年來，磺胺二甲

3、基嘧啶及萊克多巴胺殘留已成為人們共同關(guān)注的重大問題。
　　 以GC、MS、LC技術(shù)為基礎(chǔ)建立了檢測(cè)Rac、SM2的確證方法，這些方法具有高度的敏感性，但所需儀器設(shè)備昂貴、前處理繁瑣、檢測(cè)費(fèi)時(shí)，要完成大量樣品的檢測(cè)存在較大的困難，因此，目前急需簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、能夠用于大批樣品的檢測(cè)方法。本研究旨在研發(fā)敏感特異、簡(jiǎn)單快速、能用于日常監(jiān)督和檢測(cè)的可靠篩選方法。在該研究中重點(diǎn)集中于BSA-SM2、BSA-Rac的免疫原性的研究，建立

4、了能夠高效分泌SM2、Rac單抗的雜交瘤細(xì)胞9株，并制備生產(chǎn)了上述單抗。設(shè)計(jì)研發(fā)了SM2、Rac殘留檢測(cè)試劑盒4種、快速檢測(cè)試紙條2種，產(chǎn)品性能通過了HPLC、C-C-MS的確證。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 在分析Rac分子結(jié)構(gòu)和免疫原性的基礎(chǔ)上，利用化學(xué)修飾法將活性基團(tuán)羧基引入Rac苯環(huán)上，應(yīng)用混合酸酐法使引入的活性基團(tuán)羧基與牛血清白蛋白（BSA）分子上的氨基發(fā)生反應(yīng)形成酰胺鍵，制備BSA-Rac結(jié)合抗原，用同樣的方法制備OVA

5、-Rac。用重氮化法將SM2偶聯(lián)于BSA和雞卵清蛋白OVA，合成人工免疫原BSA-SM2和包被抗原OVA-SM2,通過紅外（IR）、紫外（UV）、SDS-PAGE分析，證明藥物與蛋白成功偶聯(lián)，BSA-SM2、BSA-Rac分子結(jié)合比分別約為1：19和1：20；小鼠免疫實(shí)驗(yàn)證明，上述人工抗原能夠誘導(dǎo)針對(duì)藥物的特異性抗體。
　　 用BSA-SM2、BSA-Rac免疫Balb/c鼠5次，SM2、Rac抗體效價(jià)均達(dá)到了6.4×103，S

6、M2半數(shù)抑制濃度（IC50）為9.51 ng/mL，Rac的IC50為7.11 ng/mL，經(jīng)瓊脂擴(kuò)散、阻斷ELISA、膠體金印跡實(shí)驗(yàn)鑒定，除磺胺甲基嘧啶與SM2抗體輕微交叉外，其它化合物與SM2抗體和Rac抗體均無交叉反應(yīng)。
　　 以聚乙二醇（PEG1500）為融合劑，將免疫鼠脾細(xì)胞與NS0瘤細(xì)胞融合建立了雜交瘤細(xì)胞系，獲得了穩(wěn)定分泌抗SM2和Rac高親和力、高敏感性抗體的雜交瘤細(xì)胞9株。SM2雜交瘤細(xì)胞株分別為SM2H10，

7、SM2E2,SM2A10和SM2G5，細(xì)胞上清效價(jià)為3.2×102-6.4×102,腹水效價(jià)為6.4×104-3.2×105，單抗亞型為IgG2a/κ，IgG1/λ，IgG1/κ，親和常數(shù)（Ka）為3.71×108-2.21×109L/mol。Rac雜交瘤細(xì)胞株分別為RacB5，RacC3，RacE6，RacH1和RacF4，細(xì)胞上清效價(jià)為3.2×102-6.4×102,腹水效價(jià)為1.28×105-6.4×105，單抗亞型為IgG2a/

8、κ，IgG2b/λ，IgG1/κ，IgG2a/λ，親和常數(shù)（Ka）為5.46×108-3.43×109L/mol。
　　 研制出了SM2、Rac快速檢測(cè)試劑盒A（SM2-Kit A，Rac-Kit A）和試劑盒B（SM2-Kit B，Rac-Kit B），試劑盒A的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，符合4參數(shù)logit曲線擬合，線性檢測(cè)范圍為1.0-128.0 ng/mL，檢測(cè)限為1.0 ng/mL。SM2-KitA和Rac-KitA飼料的平均添

9、加回收率分別為89.4％、89.1％、豬尿的平均添加回收率分別為90.5％、91.8％；平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15％；SM2-KitA與磺胺甲基嘧啶的交叉反應(yīng)率為2.75％，Rac-Kit A與其他化合物無交叉反。不同稀釋基質(zhì)對(duì)SM2-KitA和Rac-Kit A的檢測(cè)結(jié)果沒有影響；試劑盒在4℃保存，有效期為6個(gè)月。試劑盒B稍遜于試劑盒A，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明兩者均可用于SM2、Rac殘留的快速檢測(cè)。利用膠體金標(biāo)記技術(shù)，成功研制了SM2、

10、Rac殘留快速檢測(cè)試紙，兩種試紙的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線呈S型，符合4參數(shù)logit曲線擬合。Rac-Strip、SM2-Strip機(jī)讀檢測(cè)限分別為0.154 ng/mL和0.165 ng/mL，目測(cè)檢測(cè)限分別為2.0 ng/mL和3.0 ng/mL，SM2-Strip與磺胺甲基嘧啶有輕微交叉反應(yīng)，Rac-Strip無交叉反應(yīng)，檢測(cè)試紙?jiān)?℃保存，有效期為12個(gè)月。
　　 HPLC確證實(shí)驗(yàn)表明，SM2-strip和HPLC之間的差異為1.

11、3％-4.3％，SM2-kit和HPLC之間的差異為2.5％-4.6％；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析證明SM2-strip及SM2-kit和HPLC檢測(cè)結(jié)果無顯著差異。GC-MS確證實(shí)驗(yàn)表明，Rac-strip和GC-MS的差異為1.0％-4.7％，Rac-kit和GC-MS的差異為1.1％-4.0％，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析證明Rac-strip、Rac-kit和GC-MS檢測(cè)結(jié)果無顯著差異。SM2和Rac試劑盒和試紙條，具有特異敏感、簡(jiǎn)單快速、易于操作、經(jīng)濟(jì)實(shí)