多西環(huán)素殘留免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、多西環(huán)素(Doxycycline,DOX)為四環(huán)素類抗生素(Tetracycline,TCs),,通常用來治療動(dòng)物傳染病,還被用作飼料添加劑,以預(yù)防疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。在實(shí)際工作中,由于隨意加大使用劑量和不遵守休藥期,造成藥物在動(dòng)物組織中殘留。四環(huán)素類藥物長(zhǎng)期殘留在動(dòng)物組織中,導(dǎo)致耐藥菌在人類之間傳播,嚴(yán)重?fù)p害人體健康。很多國(guó)家和國(guó)際組織通過建立動(dòng)物性食品中獸藥殘留的有效檢測(cè)方法,來控制藥物殘留問題。如,我國(guó)和歐盟對(duì)DOX在動(dòng)物組織中殘

2、留最高殘留限量(MRL)作了明確規(guī)定:肌肉、肝臟和腎臟的MRL分別為100μg/kg、300μg/kg和600μg/kg。為了控制獸藥殘留,保障人類健康,有必要建立一種快速、有效的殘留檢測(cè)方法對(duì)其殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
　　 現(xiàn)有的DOX殘留檢測(cè)的方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、高效薄層色譜(HPTLC)、薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、流動(dòng)注射、熒光法分析和時(shí)間分辨熒光光譜分析方法。雖然高效液相和質(zhì)譜檢測(cè)

3、等儀器方法,在鑒定藥物種類和定量分析上表現(xiàn)出良好的性能,但由于其操作復(fù)雜、分析費(fèi)用昂貴,而不適用于對(duì)大量樣品進(jìn)行殘留篩選。免疫分析技術(shù)以其靈敏、特異、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)在藥物殘留檢測(cè)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。目前,僅有TCs免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),檢測(cè)DOX免疫學(xué)檢測(cè)方法很不完善,因此開發(fā)一種能快速檢測(cè)DOX殘留的免疫學(xué)檢測(cè)方法,對(duì)其殘留篩選具有重要價(jià)值。
　　 本研究對(duì)DOX的免疫原性,人工抗原的合成、兔抗DOX多克隆抗體(Anti-DOXpA

4、b)和抗DOX單克隆抗體(Anti-DOX mAb)制備及其特性、ELISA方法確立及其性能測(cè)定、免疫膠體金試紙條(Test-strip)的研制及其性能測(cè)定、高效液相檢測(cè)方法和ELISA方法、Test-strip方法的等同性確證等進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.免疫原和包被原的合成與鑒定
　　 用重氮法和混合酸酐法合成免疫原(DOX-PABA-BSA),包被原(DOX-PABA-OVA);用赫夫曼反應(yīng)和重氮法合

5、成免疫原(DOX-BSA),包被原(DOX-OVA)。通過紅外(IR)掃描、紫外掃描(UV)和SDS-PAGE凝膠電泳鑒定,證明免疫原(DOX-PABA-BSA、DOX-BSA)偶聯(lián)成功,其分子結(jié)合比分別為12.3:1和5.8:1。將免疫原DOX-PABA-BSA和DOX-BSA免疫小鼠后,對(duì)鼠抗血清(DOX pAb)的進(jìn)行ELISA方法檢測(cè),獲得了高效價(jià)、敏感、特異的抗DOX血清,并進(jìn)一步證明免疫原和包被原偶聯(lián)成功。
　　 2

6、.抗DOX單克隆抗體和多克隆抗體的制備及免疫學(xué)特性鑒定
　　 按照不同免疫劑量和免疫間期,用免疫原(DOX-PABA-BSA、DOX-BSA)免疫新西蘭大白兔6只,免疫后獲得了Anti-DOX pAb,來自2＃免疫組的兔抗體(pAbⅡ),經(jīng)間接ELISA效價(jià)測(cè)定為1:3.2×105,半數(shù)抑制濃度(IC50)為10.65μg/L,與TCs交叉反應(yīng)率(CR％)較低,其中四環(huán)素(Tetracycline,TC)為2.34％,金霉素(C

7、hlortetracycline,CTC)為1.46％,和土霉素(Oxytetracycline,OTC)為5.07％,與其它化合物無CR。
　　 用免疫原(DOX-PABA-BSA、DOX-BSA)免疫Balb/c小鼠,應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù),篩選出2.3/3A6、2.1/2F8、2.1/4H10共3株雜交瘤細(xì)胞。用細(xì)胞株2.3/3A6,體內(nèi)誘生腹水法制備腹水抗DOX單克隆抗體(Anti-DOX mAb)。間接ELISA法測(cè)定雜交瘤

8、細(xì)胞培養(yǎng)液上清和腹水的效價(jià)分別為1:1280和1:32000。競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)得腹水中Anti-DOX mAb的IC50為36.19μg//L,與TCs的交叉反應(yīng)很低(CR<0.3％)。雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目為90～101條,平均96.5條,同種型為IgG1。
　　 3.ELISA方法的建立及性能考核
　　 應(yīng)用免疫原DOX-PABA-BSA進(jìn)行免疫產(chǎn)生Anti-DOX pAb,建立DOX殘留快速檢測(cè)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法

9、,其檢測(cè)質(zhì)量性能較好,標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型,符合4參數(shù)logit曲線擬合,線性檢測(cè)范圍為2.5～80μg/L；在PBS、豬肌肉和豬肝臟基質(zhì)中,ELISA方法的IC50分別為10.65μg/L、16.46μg/kg(μg/L)和16.99μg/kg(μg/L),結(jié)果表明建立的ELISA方法受基質(zhì)影響不大；方法在不同基質(zhì)最低檢測(cè)限(LOD)為:豬肌肉LOD為2.65μg/kg,豬肝臟LOD為2.96μg/kg；ic-ELISA方法能夠檢測(cè)范圍為1

10、.79～80μg/L；豬肌肉的平均添加回收率分為88.24％～89.19％,豬肝為84.61％～85.54％;批內(nèi)變異系數(shù)為2.60％～13.17％,批間變異系數(shù)為8.61％～11.38％,方法的重復(fù)性好于其他檢測(cè)方法；Anti-DOX pAb與TC、CTC、OTC藥物交叉反應(yīng)率分別為2.34％、1.46％、5.07％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,ic-ELISA方法能夠檢測(cè)豬肌肉和豬肝臟樣品中的DOX殘留。
　　 4.免疫膠體金試紙條的研制

11、及性能測(cè)試
　　 依據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)(gold immunochromatography assay,GICA)原理,應(yīng)用Anti-DOX mAb研制DOX殘留快速檢測(cè)免疫金標(biāo)試紙條(Test-strip)。Test-strip的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型,符合4參數(shù)對(duì)數(shù)曲線擬合,機(jī)讀檢測(cè)限為11μg/L,目測(cè)檢測(cè)限為20μg/L；目測(cè)發(fā)現(xiàn)Test-strip與其他抗生素?zé)o交叉反應(yīng)。
　　 5.ELISA和金標(biāo)試紙條檢測(cè)方法與H

12、PLC確證的比較
　　 選擇12頭15 kg左右的長(zhǎng)大二元雜交去勢(shì)健康仔豬,隨機(jī)分為6組,第一組為對(duì)照組,其它5組為試驗(yàn)組。對(duì)照組飼喂不含任何抗菌藥物的飼料,試驗(yàn)組以2.5 mg/kg體重劑量的DOX注射液在仔豬頸部肌內(nèi)注射,一日1次,連用4 d。給藥后于0 d、3 d、6 d、10 d、16 d隨機(jī)各宰殺一組豬2頭,快速采集肌肉、肝樣品,并進(jìn)行ELISA、Test-strip和HPLC檢測(cè)。用ELISA方法和HPLC方法檢測(cè)組

13、織樣品,兩種方法檢測(cè)結(jié)果有很好的相關(guān)性。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA、Test-strip和HPLC方法平行對(duì)豬肌肉和肝臟樣品進(jìn)行測(cè)試,檢測(cè)結(jié)果3種方法有很好相關(guān)性,ELISA和Test-strip檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠,適合于DOX殘留快速檢測(cè)。
　　 本研究首次應(yīng)用Anti-DOX pAb建立ELISA方法和應(yīng)用Anti-DOX mAb建立Test-strip的方法檢測(cè)DOX殘留,為其它獸藥小分子化合物的免疫學(xué)殘留分析提供了基礎(chǔ)。該方法靈敏