應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼的敏感性.pdf

1、目的：建立一種用流式細(xì)胞術(shù)快速檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼敏感性的方法。
　　方法：1.摸索FDA染料在流式細(xì)胞術(shù)中鑒別結(jié)核分枝桿菌活性的最適作用時(shí)間及濃度（前期實(shí)驗(yàn)）。利用結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)的非特異性酯酶能水解二乙酸熒光素（FDA）的特性，選用FDA作為熒光染料并摸索其在流式細(xì)胞術(shù)中鑒別結(jié)核分枝桿菌活性的最適作用時(shí)間及濃度：通過觀察結(jié)核分枝桿菌株制備的不同比例死活菌（0、25％、50%、75%、100%）菌懸液在相同F(xiàn)DA作用濃度，不

2、同作用時(shí)間（10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min）以及相同作用時(shí)間（60min），不同F(xiàn)DA作用濃度（100、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 ng/ml）時(shí)平均熒光強(qiáng)度MFI（Mean fluorescence intensity MFI）的變化以確定 FDA染料在流式細(xì)胞術(shù)中鑒別結(jié)核分枝桿菌活性的最適作用時(shí)間及濃度。2

3、.測定結(jié)核分枝桿菌對異煙肼（INH）的敏感性。我們首先檢測臨床分離到的10株結(jié)核分枝桿菌對INH的敏感性，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物在不同INH藥物濃度（5ug/ml、1ug/ml、0.2ug/ml、0.1ug/ml、0.05ug/ml）作用24、48、72h后所檢測到的MFI與陽性對照（未和藥物接觸菌）的MFI比值，從而初步推斷出區(qū)分耐藥或敏感株的IHN臨界濃度及最適培養(yǎng)時(shí)間；在此基礎(chǔ)上通過檢測20例臨床分離菌株在縮小藥物濃度范圍（0.1

4、ug/ml、0.075ug/ml、0.05ug/ml、0.025ug/ml）后所檢測到的MFI與陽性對照的MFI比值進(jìn)一步確定IHN臨界濃度，并將30株臨床分離的結(jié)核分枝桿菌菌株所得流式藥敏結(jié)果與傳統(tǒng)的比例法檢測結(jié)果進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：1.經(jīng)FDA染色后的100%純活菌,在FDA作用50min以后MFI上升比率快且穩(wěn)定；進(jìn)一步觀察FDA對不同比例（0、25%、50%、75%、100%）死活菌混懸液分別染色30、45、60min，

5、在作用60min以后MFI值相對穩(wěn)定；2.經(jīng)FDA染色后的100%純活菌，MFI值在FDA作用濃度為300ng/ml時(shí)上升比率較快且相對穩(wěn)定,進(jìn)一步觀察三種FDA濃度（200、250、300 ng/ml）對不同比例死活菌混懸液染色60min后，其MFI值在FDA終濃度為250ng/ml時(shí)可最大限度區(qū)分死活菌。2.以敏感指數(shù)（藥物管MFI/純活菌管MFI）大于或等于0.8及IHN臨界濃度0.05ug/ml為判斷標(biāo)準(zhǔn)，30例臨床分離的結(jié)核分