胰島素抵抗大鼠認知功能及其腦組織APP代謝及吡格列酮干預效果的研究.pdf

1、研究背景：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要表現(xiàn)為進行性認知功能障礙。隨著人口老齡化程度的加快,AD在全球的發(fā)病率將逐步提高,給家庭及社會帶來了沉重的負擔。雖在臨床中尚能識別此類疾病,但AD的發(fā)病機制尚不明確,無有效的治療措施。近年來研究結(jié)果顯示胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是認知功能下降的重要危險因素之一。較多研究證實胰島素抵抗與AD

2、發(fā)病密切相關(guān),但其具體機制尚不十分清楚。因此,從分子水平上探討胰島素抵抗與AD的關(guān)系,對AD的防治具有重要的意義。
　　 體外實驗研究發(fā)現(xiàn)胰島素能通過調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursorprotein,APP)代謝,進而影響β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)的生成。有文獻報道胰島素抵抗能導致Aβ生成異常增多和Tau蛋白過度磷酸化,但對胰島素抵抗狀態(tài)下腦組織APP代謝βγ-分泌酶(β,γ-secretas

3、e)與胰島素降解酶(insulindegradation enzyme,IDE)表達的變化報道較少。
　　 目前改善胰島素抵抗的主要措施有運動鍛煉、飲食干預及胰島素增敏劑。吡格列酮是一種新型的胰島素增敏劑,屬于噻唑烷二酮類藥物,主要通過激活過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated,PPARγ)發(fā)揮作用。有研究報道PPARγ激動劑能改善AD患者的認知功能,提示從胰島素抵抗的角

4、度防治AD可以取得一定的療效。
　　 目的：
　　 本研究采用高果糖喂養(yǎng)Wistar大鼠建立胰島素抵抗大鼠模型,觀察胰島素抵抗大鼠行為學、腦組織膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性及APP代謝、Aβ生成的變化;從分子生物水平上,探討胰島素抵抗對動物腦損傷的可能機制及其與APP代謝、Aβ生成的相關(guān)性,以及吡格列酮在胰島素抵抗大鼠腦損傷中的干預效果。
　　 方法
　　 45只6～8周齡清潔級健康雄性Wistar大

5、鼠(購于山東大學實驗動物中心),體質(zhì)量200～220g,適應性喂養(yǎng)1周,從中隨機選取10只作為正常對照組(NC組),標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng),飲用自來水:其余35只按照標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng),給予10％果糖水制作胰島素抵抗模型。4周后,根據(jù)胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index,IRI)將制作成功的胰島素抵抗大鼠隨機分為兩組,即胰島素抵抗組(IR組)和吡格列酮組(pioglitazone,PIO組)。吡格列酮的干

6、預方法:胰島素抵抗模型成功建立后,IR組與PIO組繼續(xù)按照標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng),飲用10％果糖水直至實驗結(jié)束。PIO組同時按照吡格列酮(10mg'kg-1'd-1)灌胃給藥,而NC組與IR組灌服相應體積的生理鹽水,共計12周。干預12周后,進行以下檢測:1.測定各組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、胰島素水平,計算胰島素抵抗指數(shù);2.通過Morris水迷宮實驗觀察大鼠行為學的變化;3.化學比色法測定各組大鼠腦組織內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline

7、acetyltransferase,ChAT)的活性;4.免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)法檢測各組大鼠腦組織β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ42)的表達;5.免疫印跡法(western blot)檢測各組大鼠腦組織內(nèi)APP、β-分泌酶(β-secretase,BACE-1)、早老素-1(presenilin,PS-1)、胰島素降解酶(insulin degradaion enzyme,IDE)的

8、表達。6.對腦組織切片進行尼氏染色,鏡下觀察各組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)及尼氏體的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、胰島素水平的比較
　　 吡格列酮干預第12周后,IR組和PIO組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖較NC組有增高趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);IR組和PIO組大鼠胰島素水平較NC組增高(P＜0.01或P＜0.05);與IR組相比,PIO組大鼠胰島素水平降低(P＜0.01)。IR組與

9、PIO組的胰島素抵抗指數(shù)較NC組增高(P＜0.01),與IR組相比,PIO組大鼠胰島素抵抗指數(shù)下降(P＜0.01)。
　　 2.各組大鼠Morris水迷宮實驗成績的比較
　　 IR組與PIO組大鼠逃避潛伏期較NC組延長(P＜0.01或P＜0.05),與IR組相比,PIO組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.01)。
　　 3.各組大鼠腦組織膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)活性的比較
　　 與NC組相比,IR組與PI

10、O組大鼠腦組織內(nèi)ChAT活性明顯降低,且差異有顯著性(P＜0.01);PIO組較IR組大鼠腦組織內(nèi)ChAT活性增強,其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.免疫組織化學法檢測Aβ42蛋白表達
　　 NC組大鼠海馬區(qū)細胞排列緊密,胞體小,鏡下可見Aβ42在胞漿內(nèi)表達,表達較弱;與NC組相比,IR組大鼠神經(jīng)元細胞排列疏松,胞體較大,Aβ42表達呈強陽性(P＜0.01);PIO組大鼠神經(jīng)元細胞較IR組排列較緊密,陽性表

11、達減弱(P＜0.01)。
　　 5.免疫印跡技術(shù)檢測各組大鼠腦組織APP、BACE-1、PS-1及IDE蛋白表達
　　 (1)IR組和PIO組APP蛋白表達水平較NC組升高,蛋白表達相對系數(shù)分別為NC組的2.66倍、1.75倍;與IR組相比,PIO組APP蛋白表達水平下降34.23％,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 (2)與NC組相比,IR組和PIO組BACE-1蛋白表達水平增高,其蛋白表達相對系數(shù)分別

12、為NC組的2.41倍、1.61倍;PIO組蛋白表達較IR組下降22.22％,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 (3)IR組和PIO組PS-1蛋白表達水平較NC組升高,分別為NC組2.11倍、1.61倍;與IR組相比,PIO組PS-1蛋白表達水平下降23.85％,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 (4)IR組和PIO組IDE蛋白表達水平較NC組降低,分別為NC組0.577倍、0.836倍,其差異有顯著性(

13、P＜0.01);與IR組相比,PIO組IDE蛋白表達水平升高44.93％,其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 6.各組大鼠神經(jīng)元形態(tài)的改變
　　 尼氏染色:鏡下可見NC組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)正常,胞核膜和核仁清晰;IR組大鼠額葉皮質(zhì)、海馬的細胞排列疏松,細胞間隙增大,細胞漿內(nèi)Nissl體減少或消失。PIO組較IR組有所改善,神經(jīng)元細胞排列較整齊、密集,胞漿中Nissl體較豐富。
　　 結(jié)論：
　　

14、1.胰島素抵抗大鼠腦神經(jīng)細胞發(fā)生病理性損害,認知功能下降。與腦組織膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性下降,乙酰膽堿合成減少有關(guān)。
　　 2.胰島素抵抗大鼠腦組織內(nèi)APP、BACE-1及PS-1蛋白表達增加,IDE蛋白表達下降,提示胰島素抵抗通過上調(diào)β、γ分泌酶的活性,同時,抑制IDE的活性,使Aβ42在腦內(nèi)積聚增加。提示胰島素抵抗是AD發(fā)生病理改變重要因素之一。
　　 3.吡格列酮通過改善胰島素抵抗,增加中樞ChAT活性,維持膽堿能神經(jīng)

15、功能,對胰島素抵抗大鼠記憶減退具有改善作用。同時,吡格列酮通過對BACE-1、PS-1及IDE的作用,繼而減少Ap在腦內(nèi)聚積。提示吡格列酮可能是改善AD癥狀的主要手段之一。
　　 意義
　　 本課題通過運用免疫印跡技術(shù)、免疫組織化學技術(shù)、尼氏染色、化學比色法及Morris水迷宮實驗等方法,觀察吡格列酮干預前后胰島素抵抗大鼠腦組織中Aβ42、APP、BACE-1、PS-1、IDE表達以及大鼠逃避潛伏期的變化,了解胰島素抵抗