樹莓超氧化物歧化酶的分離純化及其部分性質研究.pdf

1、超氧化物歧化酶是體內自由基主要清除劑之一，簡稱為SOD?，F(xiàn)已證明樹莓是富含SOD的水果資源。本文以樹莓為原料，通過鹽析、凝膠層析、離子交換和金屬螯合親和層析等步驟對樹莓SOD進行純化，并對其部分性質進行研究。這些為樹莓SOD的進一步深入研究及其在藥品、保健食品和化妝品的應用中打下了一定基礎。 首先對抽提緩沖液的pH值、抽提體積和抽提次數(shù)進行優(yōu)化，得出最佳的抽提條件：pH值為7.8，抽提體積為三倍，抽提次數(shù)為兩次。同時通過(NH4

2、)2SO4鹽析沉淀實現(xiàn)分級分離，考察了不同飽和度(NH4)2SO4沉淀的酶活力，得出(NH4)2SO4飽和度為50～90％時，能夠達到最大酶活。 然后利用凝膠層析初步純化樹莓SOD。純化條件：柱體1.6×60cm；磷酸鹽緩沖液pH7.8、2.5mmol/L；流速0.3ml/min;每管收集3ml。經過SephadexG-100層析分離純化得到三種SOD同工酶。 分別通過DEAE-52層析和金屬螯合親和層析進一步對樹莓SO

3、D純化，并比較兩者純化效果。DEAE-52層析純化條件：柱體2.6×60cm；梯度洗脫液pH7.8、2.5mmol/1(250ml)～200mmol/1(250ml)磷酸鹽緩沖液；流速0.7ml/min；每管收集3.5ml。金屬螯合親和層析純化條件：柱體1.0×40cm；離子載體0.1mol/LCuSO4；檸檬酸緩沖液pH5.0、0.1mol/L；流速0.5ml/min；每管收集5ml。通過比較得出，金屬螯合親和層析純化得到SOD的回收

4、率和純化倍數(shù)均高于DEAE-52層析，因此金屬螯合親和層析更有利于SOD的進一步純化。 再利用SOD活性染色和SDS-PAGE電泳進行純度鑒定和亞基分子量測定。三種SOD均達到電泳純；三種SOD的亞基分子量分別為：SODⅠ為24000D，SODⅡ為22000D，SODⅢ為18000D。 最后對樹莓SOD的理化性質進行研究，即SOD敏感性實驗，最大紫外吸收峰和溫度、pH值、離子強度及金屬離子等因素對SOD的影響。三種酶均對

5、KCN和H2O2不敏感，說明這三種酶都屬于Mn-SOD；其最大紫外吸收峰均為280nm；溫度對其影響相對穩(wěn)定，SODⅢ受溫度的影響稍大些，而SODⅠ和SODⅡ受溫度的影響較??；在pH7～9范圍內SOD相對酶活力較高，pH過高或過低SOD均易失活；三種SOD受離子強度的影響較小；三種SOD受金屬離子的影響沒有很大的差異，Al3+、Cu2+、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+都具有一定程度的激活作用，而Pb2+、Fe3+、Sn2+則具有非常