抗人Endoglin單鏈抗體的制備及其在荷人卵巢癌裸鼠體內(nèi)放射免疫顯像初探.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文抗人Endoglin單鏈抗體的制備及其在荷人卵巢癌裸鼠體內(nèi)放射免疫顯像初探姓名：趙澤文申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師：史常旭20081101第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文一起，是一種高效的篩選系統(tǒng)。在抗原表位的模擬、蛋白質(zhì)工程的改造、單鏈抗體的制備、藥物篩選及疫苗研制等方面，具有廣泛的用途?；谝陨戏治?，本研究擬應(yīng)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)制備特異性抗人Endoglin單鏈抗體，并研究其生物學(xué)活性和體內(nèi)靶向腫瘤新生

2、血管內(nèi)皮的作用，為探索早期卵巢癌診斷方法的研究奠定基礎(chǔ)。研究目的：制各抗人Endo鰣in單鏈抗體，并檢測其生物學(xué)活性；初步探討抗人Endoglin單鏈抗體在荷人卵巢癌裸鼠體內(nèi)腫瘤放射免疫顯像中的應(yīng)用。研究方法及結(jié)果：研究共分四部分。第一部分：以rhEndoglin(即重組人Endoglin胞外段)蛋白免疫Balb／c小鼠，純化免疫成功小鼠脾臟的mRNA，用R■PcR方法擴(kuò)增出抗人Endoglin抗體的可變區(qū)基因，1％瓊脂糖凝膠電泳示，重

3、鏈和輕鏈可變區(qū)基因大小分別為約340bp和約325bp，與預(yù)期相符；用重疊延伸PCR經(jīng)Linker序列把重鏈和輕鏈可變區(qū)基因連接成單鏈抗體基因，l％瓊脂糖凝膠電泳示，該基因大小約750bp，與預(yù)期相符，并用SfiI和NotI雙酶切該基因；第二部分：把雙酶切的抗人Endoglin單鏈抗體基因克隆入經(jīng)同樣雙酶切的噬菌粒載體pCANTAB5E中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ec01iTGl，再經(jīng)輔助噬菌體M13K07感染，成功構(gòu)建抗人End091in單鏈抗體

4、噬菌體呈現(xiàn)文庫，庫容量約為398106；用rhEndoglin抗原對(duì)文庫進(jìn)行5輪吸附一洗脫富集paIlning淘篩，繼之用噬菌體ELISA篩選鑒定具有抗原結(jié)合能力的陽性重組噬菌體克隆，結(jié)果一次性從隨機(jī)挑選的94個(gè)重組噬菌體克隆中篩選到37個(gè)陽性克隆，陽性克隆檢出率約為3936％；據(jù)噬菌體ELISA結(jié)果，對(duì)抗原親和力最強(qiáng)的重組噬菌體克隆測序，獲得單鏈抗體基因序列；經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因全長為738bp，共編碼246個(gè)氨基酸殘基。其中重鏈可

5、變區(qū)基因編碼122個(gè)氨基酸殘基，位于單鏈抗體的N端，輕鏈可變區(qū)基因編碼109個(gè)氨基酸殘基，位于單鏈抗體的c端。兩個(gè)可變區(qū)之間通過(Gly4Ser)3組成的15肽連接。經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，未發(fā)現(xiàn)任何與該單鏈抗體基因相同的序列；用ANTHEPROTv50軟件對(duì)單鏈抗體蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，計(jì)算出目的蛋白的分子量為25925818Da。在重鏈和輕鏈可變區(qū)各有2個(gè)半胱氨酸，可形成2個(gè)二硫鍵。預(yù)測其等電點(diǎn)pI=9015。并在生物醫(yī)學(xué)網(wǎng)站，自動(dòng)建模獲